国家自然科学基金(30670107)
- 作品数：10 被引量：19H指数：3
- 相关作者：毛旭虎顾江杨琴邹全明张卫军更多>>
- 相关机构：第三军医大学江苏省疾病预防控制中心重庆医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划重庆市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 肠出血性大肠埃希菌O157：H7 TCCP蛋白与宿主细胞IRTKS蛋白的相互作用被引量：1
- 2011年
- 目的通过体外结合实验验证EHEC O157:H7内膜素受体偶联细胞骨架蛋白重复片段与人肠上皮细胞IRTKS蛋白SH3结构域之间的相互作用,并制备二者蛋白复合体,为利用晶体学方法研究其相互作用奠定基础。方法将IRTKS蛋白的SH3结构域cDNA序列克隆至pET30a表达质粒,转化BL21(DE3),诱导表达纯化SH3(IRTKS)蛋白;制备TCCP重复片段TC-CP(3R)蛋白;将SH3(IRTKS)与TCCP(3R)按照不同比例混合后,非变性丙烯酰胺凝胶电泳鉴定两者相互结合后产物;利用分子筛层析收集标准蛋白、TCCP(3R)、SH3(IRTKS)和TCCP(3R)-SH3(IRTKS)复合体的出峰体积,回归计算复合物的分子量,分析蛋白相互结合的比例。结果成功克隆表达了SH3(IRTKS)重组质粒;并制备了高纯度的SH3(IRTKS)和TCCP(3R)蛋白;非变性丙烯酰胺凝胶电泳结果证实TCCP(3R)与SH3(IRTKS)发生相互作用形成了蛋白质复合体;复合体的分子量约为33 000,二者相互结合的比例约为1:1。结论本研究为TCCP重复片段与SH3(IRTKS)相互作用提供了直接证据,同时复合体的制备,为利用晶体学研究两者的相互作用奠定了基础。
- 蒋明明顾江王海光鲁东水张卫军罗萍童文德邹全明毛旭虎
- 关键词：EHECO157:H7蛋白质复合体
- 肠出血性大肠埃希菌O157∶H7黏附HeLa细胞模型的建立被引量：4
- 2007年
- 目的建立肠出血性大肠埃希菌O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础。方法以细菌黏附HeLa细胞数量为指标,分别评价细菌数量、细菌与细胞孵育时间对细菌黏附数量的影响,得到最佳条件,最后肌动蛋白荧光染色(FAS)试验鉴定模型。结果加入细菌为1×105CFU,细菌与细胞孵育4h时,黏附细胞的数量最佳,FAS检测发现该条件下细菌能够引起细胞特异性黏附、擦拭(attaching&effacing,A/E)损伤,模型建立成功。结论成功建立O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制提供了条件。
- 余抒顾江曾浩杨琴刘艳青张卫军罗萍王庆旭毛旭虎
- 关键词：肠出血性大肠埃希菌O157:H7细胞模型HELA细胞
- 致病性大肠杆菌引发宿主细胞A／E损伤分析方法的建立被引量：2
- 2009年
- 目的建立一种能够对由致病性大肠杆菌引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤(A/E损伤)进行半定量分析的方法,为进一步研究其致病性提供评价手段。方法以大肠杆菌黏附HeLa细胞作为感染模型。采用姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色实验,通过菌落计数及肌动蛋白聚集数量定量分析,统计学处理,比较EPEC 43095、EHEC O157∶H7 Sakai株和弱毒株EHEC O157∶H7 00B015以及E.coliDH5α对HeLa细胞的黏附能力,评价它们对细胞的损伤程度。结果EPEC对细胞的黏附及擦拭性损伤程度大于EHEC(P<0.05)。EHEC Sakai和00B015在黏附能力上差异不大(P>0.05),但是,Sakai在肌动蛋白聚集形成能力方面却明显强于00B015(P<0.05)。结论成功建立了一种能够对EPEC或EHEC所引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤进行半定量分析的方法。
- 王海光顾江余抒张卫军邹全明朱凤才毛旭虎
- 关键词：肠致病性大肠杆菌肠出血性大肠杆菌
- 产志贺毒素大肠杆菌stx2a和stx2b的血清和牛奶抗体检测被引量：3
- 2008年
- 于新桥医院采集健康人群血清535份,两个屠宰场采集商品猪血清415份,5家奶牛场和1家奶站采集新鲜牛奶326份,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清(牛奶)中的stx2a和stx2b抗体.用P/N>2.1作为阳性判定标准,535份健康人群血清检测到stx2a抗体阳性和stx2b抗体阳性血清各21份(3.93%);415份商品猪血清检测到stx2a抗体阳性血清4份(0.96%),stx2b抗体阳性血清2份(0.48%);326份新鲜牛奶检测到stx2a抗体阳性血清25份(7.46%),stx2b抗体阳性血清21份(6.44%).牛奶中stx2抗体阳性率最高,健康人群血清次之,商品猪血清的阳性率最低.由此表明重庆市STEC菌株中携带stx2基因.
- 丁红雷王豪举毛旭虎朱凤才邹全明石云周维英
- 关键词：产志贺毒素大肠杆菌ELISA
- 肠出血性大肠埃希菌O157：H7 tccP基因敲除菌株的构建
- 2009年
- 目的构建肠出血性大肠埃希菌O157∶H7介导和宿主细胞的粘附与擦拭(A/E)损伤相关基因tccP敲除菌株。方法根据GenBank公布的肠出血性大肠埃希菌O157∶H7基因序列,设计PCR引物,分别扩增克隆tccP基因两端外侧的DNA片段,并与氯霉素耐药基因Cam连接后亚克隆于pBluescriptSKⅡ质粒,通过同源重组替换野生型tccP基因,采用PCR、RT-PCR以及Westernblot分别从DNA、RNA及蛋白质水平鉴定tccP基因是否被敲出。结果在DNA、RNA及蛋白质3个水平均证实Cam片段已成功替换tccP基因而整合进入O157∶H7基因组中。结论成功构建肠出血性大肠埃希菌O157∶H7tccP基因敲除菌株。
- 肖大平郭鹰张卫军顾江王海光朱凤才毛旭虎
- 关键词：肠出血性大肠埃希菌O157:H7同源重组基因敲除
- 转位紧密黏附素受体细胞骨架偶联蛋白基因克隆、表达、抗体制备及应用被引量：1
- 2012年
- 目的:克隆转位紧密黏附素受体细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,表达纯化TccP,制备其多克隆抗体并研究该抗体在EHEC O157∶H7黏附宿主细胞模型中的应用。方法:从EHEC O157∶H7 Sakai菌株基因组中克隆得到tccP基因,构建重组表达质粒pET28a-TccP。将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体,并用ELISA法和Western blot法对其进行鉴定。使用兔抗TccP多克隆抗体对EHEC O57∶H7黏附宿主细胞模型中的TccP分子进行定位研究。结果:获得了TccP cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28a-TccP;Western blot结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了相对分子质量(Mr)约37 000的目的蛋白。表达产物N端氨基酸序列测序结果与GenBank公布的基因序列推定的氨基酸序列完全一致。所制备的兔抗TccP多克隆抗体经Western blot法测定可与Mr37 000目的蛋白发生特异性结合反应;免疫荧光检测发现TccP聚集在EHEC O157∶H7黏附处细胞膜的下方。结论:成功构建了pET28a-TccP载体,获得了高纯度的重组TccP及其特异性多克隆抗体。
- 杨琴曹军皓丁进亚黄前川
- 关键词：基因表达多克隆抗体
- 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定被引量：3
- 2007年
- 目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,并研究其抗原性。方法采用PCR法自EHEC O157∶H7 Sakai菌株基因组扩增TccP基因,构建TccP原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经初步纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗TccP多克隆抗体。抗体效价及特异性用ELISA法和Western blotting法进行测定和分析。结果从EHEC O157∶H7 Sakai菌株中克隆出了1014bp的TccP基因。构建的重组质粒pET28a-TccP在大肠杆菌中获得了高效表达;以TccP免疫家兔获得了高效价多克隆抗体,Western blotting分析此抗体能与TccP发生特异性抗原抗体反应。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了TccP基因,所获TccP具有良好的抗原性,为进一步研究TccP在EHEC O157∶H7致病机制中的作用奠定基础。
- 杨琴顾江毛旭虎邹全明宋方洲丁红雷王庆旭
- 关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7基因表达多克隆抗体
- 肠出血性大肠杆菌O157:H7 TCCP蛋白研究进展被引量：1
- 2009年
- TCCP(內膜素受体偶联细胞骨架蛋白,Tir couple cytoskeleton protein)是近年研究新发现的EHEC(肠出血性大肠杆菌)O157∶H7致病分子,它经大肠杆菌Ⅲ型分泌系统转导入宿主细胞内,结合并活化宿主蛋白N-WASP(神经威奥综合症蛋白),引起肌动蛋白的聚集,最终诱导特征病理改变黏附、擦拭(A/E)损伤的形成。本文就近年来对它的研究情况作一简要综述。
- 顾江毛旭虎
- Tir细胞骨架偶联蛋白:大肠杆菌O157:H7的一种新的毒力因子被引量：2
- 2006年
- 肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的传染性病原菌,可引起多种致死性疾病的爆发流行。Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)是近年来发现的O157:H7的一种新的重要的毒力因子,在O157:H7黏附宿主细胞造成黏附擦拭(A/E)损伤过程中起重要作用,TccP相关研究对阐明O157:H7致病机制具有重要意义。
- 杨琴毛旭虎邹全明宋方洲
- 关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7
- 肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统及转位效应器蛋白的研究进展被引量：3
- 2008年
- 杨琴阎有功
- 关键词：肠出血性大肠杆菌
