湖北省自然科学基金(2003ABA118)
- 作品数：15 被引量：80H指数：5
- 相关作者：马立新陆云华蒋思婧武玉永谭秀华更多>>
- 相关机构：湖北大学滨州医学院宜春学院更多>>
- 发文基金：湖北省自然科学基金国家高技术研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学农业科学自然科学总论更多>>
- 番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究被引量：4
- 2006年
- 根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段(psbD/trnG),命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性,与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3′,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′t-rnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。
- 陆云华马立新蒋思婧
- 关键词：多顺反子基因枪法
- 甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体构建被引量：2
- 2008年
- [目的]为研究质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转化叶绿体奠定基础。[方法]根据GeneBank上的甘蓝型油菜的叶绿体DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增获得与甘蓝型油菜叶绿体基因组可发生同源重组的DNA片段,构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹对所构建载体上的表达盒进行功能鉴定。[结果]以甘蓝型油菜的叶片叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得4 357 bp的DNA片段,包含2个开放阅读框RbcL和β-CT。成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体pHBM720,而且同一多顺反子的3个基因均在大肠杆菌中得到表达。[结论]该叶绿体多顺反子单交换表达载体具有较强的通用性与安全性,比双交换表达载体更具优越性。
- 武玉永姚庆收马立新
- 关键词：甘蓝型油菜叶绿体DNA多顺反子
- 菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达被引量：4
- 2006年
- 构建了含菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因BADH基因的重组植物表达载体pLM46,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化。在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获基因转化烟草植株4株。经W estern blot等方法检测,证明BADH基因在烟草转化植株中得到了表达。
- 陆云华马立新张新
- 关键词：BADH基因烟草
- 一种新型巴斯德毕赤酵母表达载体的构建及甘露聚糖酶的表达被引量：1
- 2007年
- 目的:构建以带自身启动子的蔗糖转化酶基因(suc2)为选择标记的载体,用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法:根据已发表的蔗糖转化酶基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以啤酒酵母INVSC1总DNA为模板,扩增出包含自身启动子和终止区序列的suc2基因。将该基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了以suc2为选择标记的表达载体pPIC12K。将甘露聚糖酶基因man克隆入载体pPIC12K,用PEG/LiCl法转化毕赤酵母GS115菌株。以蔗糖为惟一碳源筛选转化子,利用底物平板检测筛选到的转化子中man基因的表达,并对重组表达菌株进行连续传代实验。结果:部分转化子周围产生明显的水解圈,证明甘露聚糖酶已经得到分泌表达;对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性。结论:以带自身启动子的suc2基因为选择标记的表达载体构建成功,并且这个新型表达载体能够对外源基因进行稳定有效的分泌表达。
- 黄生平汪昌丽马立新
- 关键词：巴斯德毕赤酵母甘露聚糖酶
- 一种通用高效的复杂载体构建的新方法被引量：19
- 2006年
- 文章报道了一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法是在PCR引物设计时,在目的片段5′端加上随机设计的接头,利用PCR克隆目的片段,再用T4DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段,产生多个首尾相匹配的黏性末端,进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以7片段拼接的水稻单交换质体定点整合表达载体pRSMGA的构建为例,应用上述方法构建只需做两次连接、转化,且其重组、转化效率高。数10次实验证明:这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法,该法至今尚未见报道。
- 陆云华马立新蒋思婧
- 关键词：T4DNA聚合酶水稻
- 水稻质体多顺反子表达载体的构建及其对烟草质体的转化被引量：5
- 2006年
- 目的尝试水稻质体多顺反子定点整合表达载体转化到烟草质体中表达。方法根据已发表的相关序列,分别设计引物,通过PCR技术克隆了一系列构建水稻质体多顺反子定点整合表达载体所需的元件:质体核糖体(16S)RNA操纵元启动子(Prrn)、质体psbA基因3′端终止子(psbA3′)、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因(aadA)、水稻质体基因组高频同源重组片段(psbC/trnG,大小3362bp),命名为crDNA、甘露聚糖酶基因(man)、绿荧光蛋白基因(gfp)。构建了水稻质体多顺反子定点整合表达载体pLM21(-psbC-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片5枪,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选。结果获得质体转基因烟草4株。用PCR、激光扫描和Westernblot等方法检测都证实man、gfp、aadA三个基因且均得到表达,用RFLP证实表达盒整合到烟草质体基因组中。结论水稻质体多顺反子定点整合表达载体已整合到烟草质体基因组中,并得到表达。
- 陆云华马立新严红
- 关键词：水稻多顺反子基因枪转化
- 植酸酶和甘露聚糖酶双功能毕赤酵母工程菌的构建和产酶分析被引量：4
- 2007年
- 根据已发表的植酸酶基因和甘露聚糖酶基因序列设计并合成引物,应用PCR技术,分别以土曲霉总DNA和质粒pHBM1201为模板,扩增出均不含假定信号肽序列的植酸酶基因phyA和甘露聚糖酶基因man,将它们各自克隆到毕赤酵母表达载体pHBM907C上,分别得到重组质粒pHBM907C-phyA和pHBM907C-man。将质粒pHBM907C-phyA上由乙醇氧化酶(AOX1)启动子和终止子引导表达、酿酒酵母α信号肽序列引导分泌的phyA表达盒式结构插入到质粒pHBM907C-man中,构成双基因表达分泌质粒pHBM907C-phyA-man。pHBM907C-phyA-man经SalⅠ酶切线性后转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,获得了同时分泌表达植酸酶和甘露聚糖酶的双功能酵母工程菌。研究了该酵母工程菌所分泌表达的重组植酸酶和甘露聚糖酶的相关酶学性质,并进行了双功能酵母工程菌的稳定性测试。
- 黄生平汪昌丽张桂敏马立新
- 关键词：植酸酶甘露聚糖酶毕赤酵母共表达
- 烟草质体多顺反子定点整合表达载体的构建和转化被引量：3
- 2005年
- 构建了烟草质体多顺反子定点整合表达载体pLM4(-psaA-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3'-psbC-)。用基因枪将该载体轰击烟草叶片5次,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草6株。用PCR、激光扫描、Westernblot和RFLP等方法检测都证实多顺反子表达盒中的3个基因甘露聚糖酶基因(man)、绿荧光蛋白基因(gfp)、氨基糖苷3'-腺苷酰基转移酶基因(aadA)已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。
- 陆云华马立新陈俊蒋思婧
- 关键词：多顺反子烟草叶绿体基因枪法
- 甘蓝型油菜羧基转移酶α亚基全长cDNA的克隆及在大肠杆菌中表达被引量：8
- 2004年
- 通过分析拟南芥与大豆的羧基转移酶α亚基的cDNA序列,运用RT PCR、RACE和基因组步行(Genomewalking)三种技术进行组合克隆,首次从油菜开花后 2 0～ 2 9天的幼胚中,克隆到质体定位的羧基转移酶α亚基的全长cDNA.同源性分析表明,其开放阅读框(ORF)编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆的羧基转移酶α亚基的同源性分别为 85 %、5 9%.将此cDNA去除叶绿体转运肽编码序列的成熟肽编码序列,克隆到表达载体pHBM6 2 5上,蛋白质印迹分析。
- 武玉永马立新蒋思婧
- 关键词：甘蓝型油菜基因表达
- 水稻多顺反子质体表达载体的构建被引量：1
- 2005年
- 根据发表的水稻叶绿体基因组序列,对比烟草高频同源重组目标区(NCBI编号:X1 5 90 1 )设计引物,用PCR的方法克隆到一段3 . 939kb叶绿体DNA片段,命名为crDNA 以其作为外源基因定点整合的同源重组片段,以来自烟草叶绿体的强启动子Prrn、甘露聚糖酶man、绿荧光蛋白gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA和终止子psbA3’,构建水稻质体多顺反子表达载体pLM3(-psbC$CPrrn -SD -man -SD -gfp -SD -aadA -psbA3’-trnm - ) 并在大肠杆菌中通过平板定性对所构建载体上的表达盒进行了功能鉴定,结果表明:在大肠杆菌中,多顺反子盒式表达结构中的三个基因(man ,gfp ,aadA)
- 陆云华马立新
- 关键词：多顺反子水稻
