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pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究被引量：8: 2012年; 目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。; 赵婧徐广贤贾伟董辉张一琳赵志军魏军; 关键词：重组腺病毒载体靶向调控

抑制miR-21表达的腺病毒载体构建、病毒包装及其对HepG2细胞的作用被引量：1: 2012年; 目的:构建能高效抑制成熟miR-21小分子表达的腺病毒载体,探讨其对肝癌细胞株HepG2的影响与机制。方法:基于miRNA sponge技术,合成一段与miR-21序列完全互补的8个重复片段,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中,经酶切、测序鉴定正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,转染至293A细胞中,包装成重组腺病毒感染HepG2细胞,通过Hochest33258染色、Western blot法及MTT试验检测细胞的凋亡与增殖水平。结果:经酶切、测序及GFP表达证实,成功构建了携带与miR-21互补的DNA片段的重组腺病毒。经Hochest33258染色、Western blot法及MTT试验证实,该重组腺病毒可以抑制HepG2细胞中miR-21的表达并抑制HepG2细胞的增殖,促进细胞的凋亡。结论:重组包装的抑制miR-21表达的腺病毒可有效的降低miR-21在HepG2细胞中的表达,抑制HepG2细胞的增殖。; 张一琳汤建中刘宏鹏张兆波徐文锦魏军徐广贤; 关键词：MIRNA SPONGE MIR-21 重组腺病毒

小鼠miRNA-203慢病毒过表达载体的构建及病毒包装与滴度测定被引量：3: 2011年; 目的构建microRNA-203(miR-203)过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定。方法利用化学合成miR-203发夹前体结构RNA(small hairpin RNAs,hRNA),并将其克隆入pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定;利用脂质体将鉴定的阳性重组pSicoR-miR-203表达载体、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三个质粒共转染到HEK-293T细胞,分别在48h和72h收获上清,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞,检测病毒滴度,并将制备的病毒颗粒尾静脉注射Balb/c小鼠,检测miR-203在小鼠体内的表达与分布情况。结果酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-203重组质粒,并成功的包装成慢病毒,病毒滴度为5×107 TU.mL-1。重组病毒在Balb/c小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均有表达。结论成功构建miR-203慢病毒表达载体,获得高效表达miR-203的慢病毒颗粒,为miR-203靶基因筛选及其功能的研究奠定了基础。; 黄学兰徐广贤贾伟王妍柏董辉魏军; 关键词：慢病毒绿色荧光蛋白

TLR4红色荧光蛋白融合载体的构建与表达: 2011年; 目的构建在哺乳动物细胞中表达的含Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)基因的红色荧光蛋白融合表达载体(pDsRed1-N1/TLR4),并观察在细胞内的表达情况。方法应用PCR扩增鼠TLR4全基因,将其克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1中,重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后,转染到Hela细胞中,并利用Western blotting鉴定TLR4蛋白在细胞中的表达。结果重组pDsRed1-N1/TLR4融合蛋白在Hela细胞中持续高表达,经连续观察发现48h红色荧光表达量最高。结论成功构建带有红色荧光蛋白的TLR4基因表达载体,为研究TLR4在细胞内的相关生物学功能及与mircoRNA之间的关系提供了方便有力的工具。; 赵婧徐广贤贾伟吴若芬师志云魏军; 关键词：基因表达红色荧光蛋白

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宁夏回族自治区自然科学基金(NZ1079)