国家自然科学基金(30200245)
- 作品数：8 被引量：10H指数：2
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- 小鼠Ii分子的克隆表达及在COS-7细胞中的亚细胞定位被引量：1
- 2006年
- 目的获取BALB／c小鼠Ii链编码基因,构建真核表达载体并在真核细胞中表达。方法RT-PCR获取BALB／c小鼠Ii链编码基因,插入pEGFP真核表达载体,脂质体转染COS-7细胞,荧光显微镜和激光共聚焦观察外源基因的表达。结果外源基因在COS-7细胞中得到高效表达,激光共聚焦的结果显示,外源基因定位在细胞的内膜系统,并能够和I-Ad分子形成聚集体。结论Ii链在真核细胞中表达后定位在细胞的内膜系统并能和I-Ad分子形成聚集体。
- 高明王海平卢媛周勇王燕宁孙红琰王全立
- 关键词：BALB/C小鼠真核表达
- 丙型肝炎病毒内源性靶向基因疫苗对荷瘤小鼠抑瘤效果的初步研究
- 2005年
- 目的研究基于恒定链的丙型肝炎病毒(HCV)NS3内源性靶向巨噬细胞表面分子Ia的分子基因疫苗对HCV NS3荷瘤小鼠的抑瘤效果,探索HCV感染基因治疗的可行途径。方法BALB/c小鼠皮下接种稳定表达HCV NS3的小鼠骨髓瘤SP2/0-NS3细胞,3 d后于股四头肌注射疫苗进行免疫治疗,2周后进行一次加强免疫。BALB/c小鼠共64只,随机分为等渗盐水对照组、空质粒pCI-neo对照组、pHCV- NS3非靶向治疗组和pHCV-NS3-Thl靶向治疗组,观察成瘤时间、肿瘤大小和小鼠的60 d存活率。结果等渗盐水、pCI-neo、pHCV-NS3、pHCV-NS3-Th1组小鼠平均成瘤时间分别为(16.17±2.55)d、(14.40 ±1.82)d、(16.75±2.36)d、(24.00±5.57)d;成瘤率分别为100.0%(13/13)、100.0%(14/14)、57.1%(8/14)和46.7%(7/15);60 d存活率分别为0、0、50.0%(7/14)和53.3%(8/15)。对四个时间点成瘤小鼠肿瘤大小比较的结果显示,pHCV-NS3-Th1组成瘤小鼠的肿瘤直径最小,与其他组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。结果显示,成瘤小鼠的平均存活时间比等渗盐水组延长6 d,比pCI-neo组延长12 d(P<0.05),比pHCV-NS3组延长6 d。结论pHCV-NS3-Th1具有延迟HCV-NS3荷瘤小鼠肿瘤形成、限制肿瘤生长、降低成瘤率、病死率以及提高存活率的作用。基于恒定链的内源性靶向性基因疫苗有望作为HCV感染防治的候选治疗性疫苗。
- 高明王海平周勇王嘉军王燕宁王全立
- 关键词：肝炎病毒丙型丙型肝炎病毒荷瘤小鼠基因疫苗抑瘤效果
- BALB/c小鼠I-A^dαβ链编码基因真核双顺反子载体的构建及表达被引量：1
- 2006年
- 目的:为了获取BALB/c小鼠I-Adα、β链编码基因,构建真核双顺反子表达载体并在NIH3T3细胞中表达,建立BALB/c小鼠MHC-Ⅱ抗原递呈细胞研究模型。方法:采用Trizol提取BALB/c小鼠脾细胞总RNA,RT-PCR获取I-Adαβ链 cDNA,连接pGEMT载体测序,正确后亚克隆至pIRES真核双顺反子表达载体;用Lipofectamine2000转染NIH3T3细胞,G418 筛选转染克隆株。RT-PCR鉴定外源基因在mRNA水平的表达;流式细胞术(FCM)鉴定外源基因在蛋白质水平的表达以及在细胞表面展示的水平。结果:建立了BALB/c小鼠I-Adαβ链编码基因真核双顺反子表达载体pIRES-I-Adαβ;pIRES-I-Adαβ转染NIH3T3细胞。在G418筛选下可获得高达72％的转染细胞;转染细胞总RNA RT-PCR显示外源基因在mRNA水平得到表达;FCM显示外源基因编码的蛋白高水平表达并定位于细胞表面。结论:为进一步研究BALB/c小鼠MHC-Ⅱ抗原递呈的分子机制奠定了基础。
- 高明王海平周勇王全立
- 关键词：BALB/C小鼠转染NIH3T3细胞
- BALB/c小鼠I-A^dαβ链RFP融合双顺反子表达载体的构建及其在COS-7中的表达被引量：4
- 2004年
- 构建了在β链C端融合红色荧光蛋白(RFP)标签的BALB/c小鼠I-Adαβ链真核双顺反子表达载体pRed-IRES-I-Ad,使用LipofectAMINE2000转染COS-7细胞,用激光共聚焦显微镜观察外源蛋白在细胞中的表达与定位。I-Adαβ分子在COS-7细胞中能够以较高的效率表达,并且在COS细胞中能形成聚集状态。与通常的真核翻译帽子结构起始相比,IRES启动真核翻译系统的效率低于前者;与空质粒对比,IRES介导的真核翻译起始,RFP的表达量较低。
- 高明王海平王燕宁周勇王全立
- 关键词：IRESRFPBALB/C小鼠
- 丙型肝炎病毒NS3基因疫苗质粒的构建、表达及其体液免疫应答
- 2010年
- 目的构建基于Ii分子的丙型肝炎病毒(HCV)内源性靶向基因疫苗质粒,并检测其在真核细胞中的表达及免疫小鼠诱导的体液免疫应答。方法通过3轮PCR,以HCV-NS3的Th1表位(1248～1261aa)取代Ii链CLIP片段编码基因,构建基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗质粒,转染COS-7细胞,RT-PCR法检测其在mRNA水平的表达;用内源性靶向基因疫苗pHCV-NS3-Th1和非靶向基因疫苗pHCV-NS3经股四头肌肌肉免疫BALB/c小鼠,以生理盐水、pCI-neo和pCI-neo-Ii作为对照,检测小鼠的体液免疫应答水平。结果转染细胞中,内源性靶向基因疫苗质粒在mRNA水平获得表达;对BALB/c小鼠的免疫结果显示,只有pHCV-NS3组小鼠可以检测到针对HCV-NS3的特异性抗体,抗体滴度可达1:1024。结论已成功构建了基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗质粒,其能够在真核细胞中表达,但不能刺激小鼠产生HCV-NS3特异性抗体。
- 高明王海平卢媛周勇王燕宁詹林盛王全立
- 关键词：丙型肝炎病毒NS3基因疫苗体液免疫应答
- 替换主要组织相容性复合物Ⅱ类分子恒定链短肽构建内源性丙型肝炎靶向基因疫苗的真核表达
- 2010年
- 本研究通过三轮聚合酶链反应（PCR），用丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的辅助性T淋巴细胞（Th1）表位替换BALB／c小鼠MHCⅡ类分子恒定链（invariant chain，Ii）短肽（CLIP）编码基因，构建了替换CLIP片段的HCV-NS3 Th1内源性靶向基因疫苗，并在真核细胞中表达，为进一步研究HCV内源性靶向基因疫苗的功能奠定了基础。
- 高明王海平卢媛周勇王燕宁詹林盛王全立
- 关键词：肝炎病毒丙型疫苗MHC
- 基于Ii分子的HCV—NS3内源性靶向基因疫苗的构建及免疫应答研究被引量：4
- 2007年
- 目的构建基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗并在真核细胞中表达，用构建的基因疫苗免疫BALB／c小鼠，研究免疫后小鼠的体液和细胞免疫应答。方法通过3轮PCR以HCV-NS3的TH1表位（1248～1261AA）取代Ii链CLIP片段编码基因，构建基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗，并在Cos-7细胞中表达；30只6～8周龄的雌性BALB／c小鼠随机分为5组，用内源性靶向基因疫苗（pHCV-NS3-TH1）和非靶向疫苗（pHCV-NS3）于股四头肌进行免疫，生理盐水、pCl-neo和pCl-neo-li作为研究对照，经过5次免疫后，取外周血对小鼠的体液免疫进行检测，取小鼠脾脏细胞对细胞免疫进行检测。结果内源性靶向基因疫苗在Cos-7细胞中得到高效表达；对BALB／c小鼠的免疫结果显示，只有HCV-NS3免疫组小鼠可以检测到针对NS3的特异性抗体，抗体滴度达到1／1024；pHCV-NS3和pHCV-NS3-TH1免疫的小鼠都可以检测到CD4^＋细胞的增殖，但pHCV-NS3-TH1免疫的小鼠CD4^＋细胞的增殖强度要明显大于pHCV-NS3免疫的小鼠（P=0．002）；在细胞因子的检测中，只有pHCV-NS3-TH1免疫组小鼠检测到IFN-7，浓度达到33．65pg／ml；只有HCV-NS3免疫的小鼠产生IL-4，浓度达到4．55pg／ml。结论基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗能够在真核细胞中表达并刺激小鼠产生CD4^＋TH1类型的细胞免疫，为HCV的疫苗开发提供了一个新思路。
- 高明王海平卢媛周勇王燕宁詹林盛王全立
- 关键词：丙型肝炎病毒免疫反应
- BALB/c小鼠I-A^dαβ链和恒定链Ii在COS-7中的共定位被引量：2
- 2004年
- 目的 :研究BALB/c小鼠I Adαβ链和恒定链Ii分子p4 1在COS 7细胞中的定位 ,探索抗原提呈的分子规律。方法 :构建了带有红色荧光蛋白标签的I Adαβ链真核双顺反子表达载体 pRed IRES I Ad和带有绿色荧光蛋白标签的恒定链真核表达载体 pEGFP Ii,使用Lipofectamine 2 0 0 0转染COS 7细胞 ,用激光共聚焦显微镜观察 2个外源蛋白在细胞中的共定位。结果 :I Adαβ分子在COS 7细胞中能够形成聚集状态 ,并且和Ii链共同定位于细胞的内膜系统。结论 :小鼠mIip4 1能够和I Adαβ分子在COS 7细胞中形成聚集体结构 ,mIip4 1分子的导向肽并不具有选择性导向作用 ,聚集体向细胞膜表面的移动很可能是通过胞吐的方式进行。
- 高明王海平王燕宁周勇王全立
- 关键词：BALB/C小鼠主要组织相容性复合物
