陕西省自然科学基金(2006C242)
- 作品数：5 被引量：12H指数：2
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- 牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化被引量：6
- 2010年
- 目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,以抗6×HisTag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。
- 李昂谢红帼梁平朱春晖石建峰饶国洲苟建重
- 关键词：牙龈卟啉单胞菌
- 牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达被引量：1
- 2011年
- 目的:构建牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)克隆表达重组子,转化于大肠杆菌BL21中,并在最适宜条件下诱导表达。方法:以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全基因组DNA为模板,利用PCR技术获得目的基因PAD,将扩增得到的PAD基因定向插入线性克隆载体PMD18-T Vector中,得到克隆重组子PMD18-T-PAD。经PCR和双酶切鉴定正确的克隆重组子PMD18-T-PAD与表达载体PET-28a经Xhol和Ncol双酶切后,在一定连接体系下,连接构建表达质粒PET-28a-PAD。鉴定正确的原核重组表达质粒PET-28a-PAD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及时间诱导下表达融合蛋白。以抗His Tag单克隆抗体为一抗,Western免疫印迹鉴定。结果:DNA测序结果表明,PAD与NCBI核酸数据库中收录的PAD序列同源性达100%;37℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,250r/min振摇培养6h的诱导条件下,PAD可高效表达。结论:本实验成功构建了PAD的克隆表达重组子,并在大肠杆菌中表达了PAD蛋白,为进一步研究PAD的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。
- 李昂朱春晖石建峰魏虹刘瑾苟建重
- 关键词：牙龈卟啉单胞菌原核表达
- 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选牙龈卟啉单胞菌共同外膜蛋白被引量：4
- 2010年
- 目的 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技术筛选多种牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）共同外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）,为针对多种Pg设计具有交叉保护作用的疫苗提供候选靶抗原.方法 应用超速离心法提取PgATCC33277、Pgw83、Pg301和Pg381菌株外膜蛋白,SELDI疏水性蛋白芯片H50检测OMP,Biomarker Wizard软件分析4种菌株OMP质谱图.结果 OMP质谱图显示,PgATCC33277、PgW83、Pg301和Pg381分别有71、74、76和72个蛋白质峰,并存在13种共同OMP 在美国国立生物信息中心蛋白库中鉴定到一种已知蛋白gil116636495,其功能尚不清楚.结论 发现13种共同OMP可作为牙周病疫苗候选抗原,证实基于SELDI-TOF-MS技术适合检测小相对分子质量（＜20000）、低丰度、疏水性蛋白,且操作简单、重复性好,可用于大规模寻找Pg的共同OMP.
- 李昂孙俊毅孙媛媛石建峰饶国洲苟建重
- 关键词：细菌外膜蛋白质类表面增强激光解吸电离飞行时间质谱
- 牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达被引量：1
- 2011年
- 目的克隆牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),并将其置于大肠杆菌中作融合表达。方法利用PCR技术,克隆GAPDH,插入克隆载体pMD18-T中得到克隆重组子pMD18-T-GAPDH。克隆重组子与表达载体pET-32a双酶切后连接构建表达质粒pET-32a-GAPDH。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果核酸序列测定与分析表明:表达重组子pET-32a-GAPDH与NCBI核酸数据库中收录的GAPDH序列同源性达99.802%;在最佳浓度的IPTG诱导下,GAPDH可高效表达。结论本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中表达了GAPDH蛋白,为后续实验研究GAPDH的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。
- 李昂徐红艳石建峰朱春晖饶国洲苟建重
- 关键词：牙龈卟啉单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶原核表达
- 联合应用二维液相色谱及串联质谱技术筛选牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白抗原的初步研究被引量：1
- 2010年
- 目的 联合应用二维液相色谱（two-dimensional liquid phase fractionation,PF2D）及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS）技术,筛选多种牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）共同外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）,为针对多种Pg设计具有交叉保护作用的疫苗提供候选靶抗原.方法 超高速离心法提取Pg301、PgATCC33277和PgW83菌株OMP,应用PF2D目标蛋白快速分离系统分离OMP,对比分析得到共同OMP,用MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱结合数据库搜索,确定蛋白质一级结构.结果 第一维色谱聚焦分离,3株Pg共获得99个蛋白质样本;选定OMP组分B7,进行第二维反相色谱分离,3株Pg共确定了8个共同的蛋白色谱峰,运用MALDI-TOF/TOF-MS对蛋白样品进行鉴定,结果 确定了其中一个为已知的蛋白精氨酸-牙龈素A.结论 PF2D分离系统分辨率高、重现性好,结合MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱技术,可用于鉴定Pg的共同OMP.
- 李昂司薇杭王嗣岑石建峰饶国洲苟建重司薇杭王嗣岑石建峰饶国洲苟建重
- 关键词：细菌外膜蛋白质类
