陕西省自然科学基金(2006C218)
- 作品数：5 被引量：21H指数：3
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- 相关机构：第四军医大学第四军医大学西京医院西北农林科技大学更多>>
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- 结核分枝杆菌热休克蛋白16．3及其合成肽诱导小鼠免疫应答的研究被引量：3
- 2009年
- 目的比较MTB的热休克蛋白（HSP）16．3和HSP16．3合成肽在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法80只BALB／c小鼠分为5组，3个实验组：蛋白组：HSP16．3／溴化二甲基双十八烷酸铵（DDA）／单磷酰脂质A（MPL），合成肽组：HSP16．3合成肽／DDA／MPL，佐剂组：HSP16．3合成肽／弗氏不完全佐剂组；2个对照组：卡介苗组和生理盐水组。每只小鼠蛋白和合成肽免疫剂量为50μg／次，共免疫3次，间隔2周。卡介苗为单次免疫5×10^6CFU／只。分别于第1次免疫后0、2、4、6、8周采集血液，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中抗HSP16．3的抗体浓度及第8周时血清中抗体滴度。末次免疫完成后4周，每组取8只小鼠分离脾淋巴细胞，用HSP16．3刺激后，噻唑蓝法测定脾淋巴细胞的增殖指数，夹心ELISA法检测相同抗原刺激下脾淋巴细胞诱生的γ-干扰素水平。每组剩余小鼠用10’CFU的H37Rv毒株攻击，4周后取小鼠脾脏和肺脏，组织匀浆，倍比稀释后涂7H10平板，4周后计数菌落数。采用LSD-t检验统计学分析。结果抗HSP16．3抗体在免疫的前4周均增长迅速，之后趋于缓和。免疫8周时，3个实验组（蛋白组、合成肽组和佐剂组）抗体水平分别为1：2000、1：2000和1：1000，均高于卡介苗组（1：500）。3个实验组（蛋白组、合成肽组和佐剂组）的脾淋巴细胞增殖指数（3．13±0．18、3．21±0．21和2．40±0．15）均显著高于卡介苗组（1．67±0．12）和生理盐水组（1．04±0．09），蛋白组和合成肽组均显著高于佐剂组。3个实验组诱生的γ-干扰素水平·（182±6）、（194±9）和（179±8）mg／L]均显著低于卡介苗组[（275±10）mg／L]，高于生理盐水组[（71±3）mg/L]，3个实验组之间均无显著差别。3个实验组均对MTB在脾脏[细菌数为（6．74±0．14）-（6．81±0．28）lgCFU]和肺脏[细菌数为（5．74±0．27）-（6．65
- 师长宏张廷芬朱德生张海白冰赵勇岳晨莉赵雷刘建利
- 关键词：分枝杆菌结核热休克蛋白质类亚单位
- 结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白稳定表达细胞系的建立被引量：1
- 2008年
- 目的构建了表达结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的P815细胞系。方法将Hsp65与IL-2基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒Hsp65-IL-2-pcDNA3.1。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB/c遗传背景一致的P815(H-2d)细胞。G418筛选抗性克隆,免疫荧光检测融合蛋白的表达。结果真核质粒转染的阳性克隆细胞,经RT-PCR检测到Hsp65与IL-2融合蛋白mRNA水平的表达,分别用抗Hsp65和IL-2的单抗进行间接免疫荧光检测,可在转染重组质粒的P815细胞膜上观察到较强的绿色荧光。结论获得表达Hsp65与IL-2融合蛋白的稳定细胞系,为其CTL研究提供了合适的靶细胞。
- 师长宏张海席丽王晓武王丽梅赵勇
- 关键词：结核分枝杆菌真核表达热休克蛋白65白细胞介素2融合蛋白
- 结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究被引量：9
- 2009年
- 目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。
- 刘建利师长宏靳亚平张海赵勇赵雷
- 关键词：AG85BESAT6融合蛋白纯化
- 结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断被引量：3
- 2009年
- 郭利民张廷芬师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌TUBERCULOSIS纯蛋白衍生物亚临床状态
- 藤黄微球菌复苏促进因子结构域及其突变体基因的克隆和表达及生物活性的测定被引量：5
- 2008年
- 目的克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子（Rpf）结构域及其突变体基因，评价其生物学活性。方法采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K，用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中，将测序正确的基因插入到pGEX-4T-1表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，经异丙基-β—D硫代半乳糖（IPTG）诱导，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达蛋白，利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western blot分析。用GS-4B亲和层析柱纯化蛋白，将纯化的蛋白加入到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性。结果获得藤黄微球菌Rpf结构域及其E54K和E54A突变体基因，测序结果与美国基因序列数据库GenBank公布的序列完全相同，突变位点与设定一致；表达蛋白相对分子质量与文献报道一致；Western blot结果显示，在相对分子质量约32000处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带。通过GS-4B系统，得到纯化的GST融合蛋白，并证实Rpf结构域蛋白对休眠的耻垢分枝杆菌有一定的复苏和促生长作用，突变体E54K对耻垢分枝杆菌的生长有抑制作用。结论获得Rpf结构域及其2种突变体蛋白，明确其对耻垢休眠菌有复苏的作用。
- 岳晨莉史皆然师长宏张海赵雷张廷芬赵勇席丽
- 关键词：突变体生物学活性
