国家自然科学基金(U0931003)
- 作品数：19 被引量：56H指数：5
- 相关作者：张桂红童光志周艳君姜一峰童武更多>>
- 相关机构：华南农业大学中国农业科学院上海兽医研究所海南省农业科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家现代农业产业技术体系建设项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学环境科学与工程更多>>
- 表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究被引量：3
- 2012年
- 为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。
- 童武周艳君徐彦召姜一峰王亚欣张善瑞朱建平虞凌雪孙晶陈焕春童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸道综合征病毒猪瘟病毒感染性分子克隆重组病毒
- 两株猪繁殖与呼吸征病毒的分离鉴定及遗传变异分析被引量：2
- 2012年
- 从广东省发病猪场采集的组织和血清中分离到两株PRRSV,病料经RT-PCR检测为阳性,通过Marc-145细胞进行传代,可产生明显细胞病变,通过间接免疫荧光可检测到荧光信号,两株病毒分别命名为ZH-GD株和ZS-GD株。对两株病毒的ORF5和Nsp2高变区进行序列测定和分析,结果表明,PRRSV ZH-GD株和ZS-GD株的核苷酸序列与欧洲型代表株LV株间的相似性相对较远,与美洲株经典毒株VR-2332间的相似性分别为88.6%和88.1%,与中国经典美洲毒株CH-1a间的相似性分别为94.4%和93.0%。在Nsp2上有30个氨基酸的缺失,与JXA1、XH-GD等高致病性变异株的Nsp2缺失位置一致。分离的两株PRRSV均属于美洲型的变异株PRRSV。
- 张超轶吴欣伟闫明菲张亮权郭泗虎黄昌力黄震张民泽赵付荣张桂红
- 关键词：PRRSV
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定被引量：5
- 2011年
- 为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据 PRRSV HuN4 株基因组序列设计并合成 PRRSV 特异性引物,应用 RT-PCR 技术分6段扩增了 PRRS VHuN4 株全基因组 cDNA。将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于 pBlueScriptⅡSK(+)载体中构建了感染性重组质粒 pHuN4。并在病毒 cDNA5'末端引入 sp6 启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段 Poly(A)尾引入 NotⅠ酶切位点用于线性化 pHuN4;此外,将 HuN4 基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个 MluⅠ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记。pHuN4 通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在 Marc-145 细胞中救获病毒。结果显示:救获的病毒能够在 Marc145 细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异。利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100%,在感染后20d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得 PRRSV 强毒 HuN4 株感染性克隆,为从基因水平上研究 PRRSV 的致病机制提供了技术平台。
- 张善瑞周艳君朱建平童武姜一峰童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性分子克隆
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株及其致弱过程中的不同代次病毒的分子特征分析被引量：6
- 2011年
- 为了追踪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,HP-PRRSV)毒力逐渐减弱的分子轨迹,我们以HP-PRRSV亲本毒HuN4株及其系列传代致弱毒株为研究对象,对HuN4株及其不同代次毒株其全基因序列进行了序列比较分析。结果显示由高致病性的亲本毒HuN4株到无致病性的F112代的疫苗毒,共有65个核苷酸发生突变,其中导致41个氨基酸发生突变,这些突变的氨基酸分散性的存在于不同基因区域。与已经报道的高致病性JXA1株及其致弱毒株JXA80株相比较,可以看到两个强毒株毒力致弱的演变轨迹并不完全相同,二者之间不仅氨基酸突变数量不一致,而且突变氨基酸的位置也不完全相同,但其共同特点是由强毒株到弱毒株的变化过程中,突变率较高的结构蛋白相一致,突变率较高的非结构蛋白基本一致。分析结果提示我们决定高HP-PRRSV毒力强弱的因素可能不是由单个氨基酸的突变来决定的,推测是由一个基因或多个基因或多种因素共同造成的,同时也使我们认识到PRRSV的非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。
- 周艳君田志军郝晓芳安同庆于海李国新陈瑾彭金美童光志
- 关键词：突变
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7片段互换嵌合病毒的构建及其生物学特性的分析被引量：3
- 2012年
- 为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。
- 姜一峰周艳君王亚欣朱建平徐彦召童武虞凌雪童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112弱毒株NSP2区表达猪瘟病毒E2基因表位的研究被引量：4
- 2013年
- 建立共表达猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV)E2蛋白主要中和性抗原表位基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,为进一步研究PRRSV作为病毒载体提供实验数据。本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因插入HuN4-F112弱毒株PRRSV已鉴定出的两个NSP2蛋白的复制非必需区,经基因片段的克隆、拼接,构建了两株含有CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因的感染性PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ508-532+E2和psk-HuN4-F112-Δ480-532+E2。用限制性内切酶SwaΙ分别将两株共表达的感染性克隆线性化,之后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法分别将病毒RNA转染BHK-21细胞包装出病毒粒子,再分别将其转接到MARC-145细胞传代拯救出两株病毒。分别对两株拯救病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,两株拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(拯救病毒基因组的14 667位因同义突变产生的MluⅠ酶切位点)和插入基因序列。间接免疫荧光试验表明,CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因均能在两株拯救的PRRSV中表达,且能够在其传代过程中稳定遗传。病毒生长特性结果比较显示两株拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了两株共表达CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因的PRRSV感染性克隆并获得了拯救病毒,且外源基因能在拯救病毒中稳定表达,为进一步开发新型PRRSV二联疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。
- 徐彦召周艳君童武李玲姜一峰童光志
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒载体
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒广州株的分离鉴定与全基因序列分析被引量：3
- 2011年
- 为了给研制基因工程疫苗选取毒株奠定基础,研究在2008年采集广东省某猪场疑似猪高热症病料1份,通过RT-PCR检测、Marc-145细胞传代,证实分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为PRRSV-GZ株,经过扩增基因序列并测序,绘制遗传进化树,结果表明:PRRSV-GZ株属于美洲缺失型毒株。
- 王文华秦宏阳曹宗喜于俊勇吴欣伟于淼孔维力刘志刚张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定被引量：1
- 2012年
- 为了对从湖南某发病猪场送检的血清中分离到的1株蓝耳病病毒进行鉴定,试验通过接种Marc-145细胞传代后产生明显而稳定的细胞病变,又经过RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)检测成功验证;通过对分离株的ORF5基因的测序结果表明,ORF5核苷酸序列与欧洲型代表株LV株及北美经典毒株VR-2332、国内经典美洲株CH-1a的相似性分别为64.5%、87.4%、93.0%,说明其属于美洲型;而将NSP2高变区的测序结果与JXA1等高致病性变异株的Nsp2比较后发现,都在同一位置不连续缺失30个氨基酸。说明成功分离到1株北美型变异株,最终将其命名为PRRSV CZ-HN株。
- 郭泗虎曹宗喜李海琴闫明菲张超轶张民泽赵付荣张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 反向遗传操作技术在猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗研发中的应用
- 2011年
- 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起猪的一种高度传染性疾病。该病自1987年首次发现以来，已遍及世界各个养猪国家，它所引发的母猪流产和仔猪的呼吸障碍给养猪业造成了灾难性的打击。特别是2006年以来，变异株PRRSV的出现则对我国养猪业的发展产生了巨大的影响。
- 郭泗虎曹宗喜李海琴闫明菲亓文宝焦培荣张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作技术病毒疫苗传染性疾病PRRSV
- PRRSV的病毒蛋白研究进展被引量：8
- 2013年
- 猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的病毒性疾病,给世界养猪业造成了极大的威胁。从猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组、非结构蛋白和结构蛋白3个方面对PRRSV的病毒蛋白研究进展进行综述。
- 曹宗喜师志海林哲敏焦培荣张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒基因组非结构蛋白结构蛋白
