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嗜水气单胞菌黏附素基因克隆、序列分析及表达被引量：2: 2010年; 利用PCR方法对江浙一带淡水鱼类暴发病病原致病性嗜水气单胞菌主要血清型O:9和O:97代表菌株TPS-30和BSK-10的黏附素基因(Al)进行扩增,并分析不同血清型和不同来源菌株Al的序列差异.结果表明:嗜水气单胞菌TPS-30株与BSK-10株相比较,Al序列在N端有个突变区,TPS-30株的Al基因突变区较BSK-10株短;通过pET28a(+)载体构建TPS-30株黏附素基因的表达载体pET28a-AHal,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约41ku相吻合的融合蛋白带,诱导6h后目的蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的44.0%;通过免疫攻毒试验发现,免疫银鲫后血清效价在第5周达到峰值,重组表达的蛋白对同源菌株TPS-30和异源菌株BSK-10都具有较高的免疫保护率,分别达到94.7%和77.8%.这为基因工程亚单位疫苗的开发奠定了基础.; 潘晓艺沈锦玉郝贵杰姚嘉赟徐洋; 关键词：嗜水气单胞菌免疫原性保护性抗原血清型

乌鳢诺卡氏菌病的组织病理学被引量：20: 2008年; 应用病理组织学、活体压片和电镜技术，运用H．E常规染色法和Ziehl—Neelsen抗酸杆菌染色法对患疑似诺卡氏菌病的乌鳢各器官进行观察。结果表明，患病乌鳢的肾脏、肝脏、头肾、脾脏、肌肉、表皮、鳃丝、鳃弓、心脏、肠道、卵巢等器官内部有大量的慢性肉芽肿结节，直径多为1～2mm。典型结节基本结构可分三层，由内向外依次为：干酪样坏死、类上皮细胞和多核巨细胞、成纤维细胞和纤维细胞包膜，中央干酪样坏死组织中有大量呈长杆状或分枝状的诺卡氏菌。结节活体压片观察到大量的长杆状或分枝状菌体。电镜观察到结节中有大量杆状菌体，未见病毒颗粒；菌体长3．5～6．5μm，宽0．45～6．8μm。器官主要组织病理学变化为：肾小管细胞变性和坏死，肾间质淋巴细胞增生；脾淋巴细胞增生和淤血；肝脂肪变性；鳃上皮肿胀，鳃丝棒状化；心肌细胞肿胀，断裂，溶解；肌纤维水泡变性，肿胀，断裂，溶解，坏死；表皮细胞变性，坏死，脱落，有炎性细胞浸润，诺卡氏菌对机体的主要器官造成严重病理损伤。对乌鳢诺卡氏菌病的组织病理变化进行了较为系统的研究，可为临床诊断和相关研究提供参考依据。; 常藕琴石存斌潘厚军付小哲吴淑勤; 关键词：乌鳢诺卡氏菌病组织病理学

养殖乌鳢结节病的病原分析被引量：14: 2009年; [目的]分析了解乌鳢结节病的病原。[方法]以患病乌鳢为研究材料,通过组织病理学观察和人工感染试验,确定乌鳢结节病的病原性质;通过基本生理生化特性、16 S rRNA基因部分序列和药物敏感性的测定,对乌鳢结节病的病原进行鉴定。[结果]组织病理学观察显示典型结节的中央为干酪样坏死,内含坏死的组织细胞和白细胞,其间有大量呈长杆状或分枝状菌丝;从病鱼的肾脏、肝脏等多个组织及腹水中均分离培养出细菌,用分离菌株作回归感染,证实分离菌株为乌鳢结节病的病原菌;通过对病原菌的基本生理生化特性测定和16 S rRNA基因部分序列分析,初步确定乌鳢结节病的病原为诺卡氏菌属的鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。[结论]该研究为乌鳢结节病的进一步研究奠定了基础。; 石存斌潘厚军常藕琴付小哲段圣和梁裕昕吴淑勤; 关键词：乌鳢结节病病原

嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达被引量：11: 2010年; 嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。; 潘晓艺郝贵杰姚嘉赟徐洋尹文林沈锦玉; 关键词：嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因溶血素基因

西伯利亚鲟停乳链球菌的分离、鉴定与致病性被引量：28: 2009年; 从患暴发性流行病的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)肝脏和心脏中各分离到1株细菌,分离纯化后获得2个分离株,编号分别为AeBF070904、AbHT070912,对分离菌进行了菌株鉴定、致病性分析及药敏实验。分别应用常规生理生化鉴定、全自动细菌测定卡API20STREP和ID32STREP进行检测,结果表明,2个分离株均为停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)。对2个分离株的16S rRNA基因进行PCR扩增和测序,并与GenBank中收录的链球菌16S rRNA基因进行序列分析并构建系统进化树,结果显示,2个分离株的16S rRNA基因序列相同,与停乳链球菌同源性最高达97.3%,在系统进化树上与停乳链球菌聚为一簇,进一步确认2个分离株均为停乳链球菌。从人工感染后发病鱼的内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同,确认停乳链球菌是西伯利亚鲟的致病菌。2个分离株对西伯利亚鲟、杂交鲟及剑尾鱼均有致死毒性,37℃培养的细菌毒力比28℃培养的细菌毒力强。2个分离株均对青霉素、诺氟沙星等7种药物敏感;对头孢唑啉、庆大霉素等2种药物耐受;对红霉素中等敏感;对卡那霉素等8种药物菌株之间出现差异。; 潘厚军刘晓勇常藕琴王庆孙慧武刘瑞明付小哲刘雨果吴淑勤; 关键词：停乳链球菌细菌鉴定 RRNA基因序列药物敏感

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备: 2009年; [目的]构建传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。; 彭媛媛付小哲石存斌余露军李宁求吴淑勤; 关键词：纯化抗体

鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证被引量：3: 2009年; 将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg/尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS)。结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50μg/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50μg/尾免疫组及100μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组与对照组无差异;在免疫后48h各剂量免疫组Mx蛋白均有低量表达,对照组无表达,各免疫组表达量无显著差异;免疫后第36天攻毒,50μg/尾免疫组的相对保护率最高,为64.3%。研究结果表明,重组MCP蛋白有较好的免疫原性,可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答,当免疫剂量为50μg/尾时,免疫保护效果最好。; 付小哲李宁求彭媛媛石存斌白俊杰吴淑勤; 关键词：传染性脾肾坏死病毒免疫保护

DNA不同提取方法对养殖池塘底泥细菌多样性PCR-DGGE检测的影响被引量：8: 2009年; 应用PCR-DGGE技术研究了养殖池塘底泥中细菌DNA 5种提取方法对细菌多样性检测的影响。结果显示:(1)DNA粗提液中腐殖酸与蛋白的纯度无正相关;(2)5种方法提取的DNA粗提液经过纯化后进行PCR均取得良好结果;(3)采用复合破壁方法提取养殖池塘底泥细菌DNA有利于显示细菌多样性;(4)DNA提取方法是影响池塘底泥细菌多样性PCR-DGGE结果的关键因素,与DNA的产量、纯度关系甚微;(5)5种方法相似性高达0.79,在对养殖池塘底泥细菌多样性进行粗略分析时均可使用;(6)本试验中,基于改进的Martin-Laurent法是用于养殖池塘底泥细菌多样性PCR-DGGE研究的较好的总DNA提取方法。; 王宇林文辉王亚军毕晔石存斌吴淑勤; 关键词：细菌多样性 DNA提取 PCR-DGGE 优势种群

鳜黏膜淋巴组织结构的初步研究被引量：2: 2009年; 采用组织学和电镜技术,应用HE常规染色方法、AB-PAS黏液细胞染色方法、免疫组织化学方法,对鳜(Siniperca chuats)黏膜淋巴组织的基本结构以及免疫相关细胞的形态、类型及其在黏膜淋巴组织中的分布情况进行了研究。结果表明,鳜的鳃弓、鳃小片基部、皮肤的表皮以及肠上皮中存在大量的黏液细胞,用AB-PAS染色方法将鳜黏液细胞分为6种类型;免疫组化方法可在鳃的血窦腔、皮肤的基底层以及肠黏膜层中检测到抗体分泌细胞的存在;透射电镜观察显示,黏膜淋巴组织中存在着黏液细胞、淋巴细胞、浆细胞、吞噬细胞、肥大细胞、朗罕氏细胞、嗜中性粒细胞等免疫相关细胞。结论认为,鳜黏膜淋巴组织具有完成免疫应答的细胞基础。; 范毛毛常藕琴石存斌王斌吴淑勤; 关键词：免疫组织化学

蛙虹彩病毒一个晚期基因的鉴定被引量：3: 2007年; 从沼泽绿牛蛙虹彩病毒(Rana gryliovirus,RGV)基因组中克隆了十四烷基化膜蛋白(myristylated membrane protein,MMP)基因的全部编码区,序列分析表明,RGVmmp基因全长972 bp,编码一个长为323 aa,分子量为35×103的蛋白.氨基酸同源性比对分析,与同为蛙病毒属的其他病毒的相应蛋白同源性都在64%以上.构建重组表达载体,进行了原核表达,获得一条约53×103的融合蛋白,并制备出抗血清.通过RT-PCR和Westernblot分析确定了RGV感染过程中mmp基因的表达时序,检测到感染4 h有转录,感染6 h有表达,且持续到感染48 h.用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和DNA复制抑制剂阿糖胞苷(AraC)分别作为蛋白合成和病毒DNA复制的抑制剂进行药物抑制实验,鉴定出mmp是蛙虹彩病毒RGV的一个晚期基因.; 徐维赵哲张奇亚; 关键词：原核表达药物抑制

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国家科技支撑计划(2006BAD03B05)

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