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国家自然科学基金(31101279): 作品数：12 被引量：53H指数：5; 相关作者：余以刚肖性龙吴晖黄韵田聪更多>>; 相关机构：华南理工大学东莞出入境检验检疫局珠海出入境检验检疫局更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金中央高校基本科研业务费专项资金更多>>; 相关领域：轻工技术与工程医药卫生生物学农业科学更多>>

猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法的建立被引量：1: 2013年; 为了建立猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法,设计了1对通用引物和2条特异性MGB探针。此外,为防止假阴性结果出现,制备了假病毒用于全程检测监控。测试了本方法的特异性,灵敏度,重复性等技术指标。结果显示,在选定的猪病相关病毒组内特异性符合率达100%;对野毒株和疫苗株的检测灵敏度分别达到1TCID50/mL和0.1 TCID50/mL;重复性实验表明组内和组间变异系数均在0.7-2.2%之间。临床比对试验结果显示,荧光RT-PCR对猪肉、脾脏和血液病料进行猪瘟野毒检测的阳性率分别为66.7%、60.0%、77.8%,而传统方法的阳性率分别为52.4%、40.0%、50.0%;检出率比传统方法要高。此外,临床试验样本中,PCR抑制物在猪肉、脾脏和血液病料中存在的比例分别为9.5%、10.0%和5.6%,显示了假病毒作为内标对PCR检测监控的重要作用。; 余以刚黄韵陶文扬章丽吴晖肖性龙赖富饶杨锡洪; 关键词：猪瘟病毒荧光RT-PCR 假病毒

LAMP实时浊度法快速检测转基因玉米MON810被引量：6: 2013年; LAMP实时浊度法是采用环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术通过实时浊度仪实时检测反应过程中所产生的白色沉淀,从而实现对扩增全过程的监控,弥补了显色法只能观看反应终点的缺陷,使引物筛选和反应体系的优化有数据可依。本研究以转基因玉米MON810为研究对象,针对外源基因苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白CryIA(b)与内源基因边界序列设计6条特异性引物,通过实时浊度法在63℃的恒温条件下完成检测,对检测的灵敏度、特异性、稳定性进行了评价。建立了转基因玉米MON810的LAMP实时浊度检测方法,该方法最低检出限为0.5%,与LAMP显色法和实时荧光PCR法进行结果比对,符合率为100%,经评价具有特异性高、稳定性强、准确简便等优点,非常适合转基因玉米MON810的快速检测,有较好的应用价值。; 王小玉邝筱珊胡松楠余以刚成晓维冯家望张璜肖性龙; 关键词：环介导等温扩增技术转基因玉米

腾冲嗜热厌氧菌耐热解旋酶Tte-uvrD的克隆表达及粗酶的初步应用: 2014年; 以腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)基因组DNA为模版,通过PCR克隆编码解旋酶Tte-uvrD的基因tte-uvrd,将该基因插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体pET-32a(+)-tte-uvrd,转入E.coli BL21中,经蓝白斑筛选和双酶切法筛选阳性重组转化子,挑取测序正确的单个阳性菌落,在IPTG诱导下表达出重组蛋白Tte-uvrD。诱导后的菌体经超声破碎和离心,上清液用硫酸铵沉淀法初步纯化,透析除盐,冻干复溶后得到粗酶液。用tHDA反应来验证Tte-uvrD粗酶液的活性,比较不同储存温度下粗酶液酶活保持的时间,并比较-20℃下储存两个月的粗酶液与商品化纯酶的tHDA反应灵敏度。结果表明,用本研究建立的克隆方法可成功克隆出耐热解旋酶TteuvrD,其粗酶液能用于tHDA反应,说明粗酶液具有解旋活性;粗酶液在-20℃下第80d酶活仍能保持稳定,4℃下则只能保持酶活约一周;-20℃下储存两个月的粗酶液能达到与商品化纯酶相当的灵敏度。; 章丽余以刚黄秀丽肖性龙; 关键词：腾冲嗜热厌氧菌

高分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌: 2013年; 为建立一种快速鉴定副溶血性弧菌的HRM(高分辨率熔解曲线)real-time PCR法,以tox R为靶基因,结合特异性引物,通过优化反应体系及条件,进行特异性、敏感性及重复性评价,并初步应用于90份送检的鲜活海产品样本的检测。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,Tm值为76.64±0.57℃;而与创伤弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等多种海产品中常见的食源性病原菌没有交叉反应。灵敏度试验表明,该方法最少可检测tox R重组质粒的浓度为3.50×102copies/mL。重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的平均Tm值分别为76.53±0.35℃和76.74±0.52℃,变异系数分别为0.56±0.42%和1.11±0.73%。对90份鲜活海产品样本的检测证实该法可使阳性检出率从国标法的14.44%提高至18.89%。本研究所建立的副溶血性弧菌HRM real-time PCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能应用于食品样本的检测,具有很好的研究价值和应用前景。; 章丽余以刚赖富饶吴晖杨锡洪肖性龙; 关键词：副溶血性弧菌高分辨率熔解曲线实时PCR 荧光

活的非可培养状态大肠杆菌O157:H7的复苏研究被引量：8: 2013年; 为研究活的非可培养状态(viable but nonculturable state,VBNC)的Escherichia coli O157:H7的复苏能力,将E.coli O157:H7分别置于LB液体培养基和生理盐水在-18℃低温条件下诱导生产活的非可培养状态E.coli。结合吖啶橙荧光显微镜计数法、活菌直接计数法和平板计数法对样本细菌检测验证,分别在第15天和第18天得到VBNC样本。采用将培养液直接升温到37℃、加入体积分数为25%酵母浸膏(25℃)和加入体积分数为8%吐温-80(37℃)3种方法进行复苏研究。同时利用荧光定量PCR技术监测从诱导到复苏整个过程中的菌数变化。结果显示:3种方法均能使VBNC状态E.coli O157:H7在2d内复苏,复苏后菌株与正常菌株形态类似;细菌进入VBNC状态15d后,采用相同的方法则无法复苏。; 田聪余以刚肖性龙李建龙吴晖; 关键词：H7

流式细胞术检测单增李斯特菌与酿酒酵母被引量：5: 2014年; 为探讨流式细胞术对单增李斯特菌和酿酒酵母的活菌与热灭活菌的检出效果,本文采用荧光染色试剂SYTO-9和碘化乙锭(PI)对单增李斯特菌和酿酒酵母的活菌与热灭活菌的细胞悬液进行染色,采用流式细胞仪同时测量红色荧光与绿色荧光从而得出细胞悬液中的细菌和酵母的含量。结果表明经核酸荧光染料染色后,再结合流式细胞术对细菌与酵母菌进行检测,步骤简单、耗时短。该法不仅简化了测量步骤且分辨率高,对单增李斯特菌和酿酒酵母均具有良好的检出结果,能分辨同一体系中同一菌种的活细胞与热灭活细胞和同一体系中的细菌与酵母活细胞;该法检出限低,将单增李斯特菌稀释后,最低检出限可达1.2×104 cells/mL,将酿酒酵母稀释后,最低检出限可达6×103 cells/mL,因此能大大缩短增菌时间或者避免繁复的增菌步骤。; 黄生权付萌唐青涛黄韵胡双芳余以刚肖性龙; 关键词：流式细胞术荧光李斯特菌酿酒酵母

金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导条件和EMA-qPCR检测被引量：5: 2013年; 为建立金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)活的非可培养(VBNC)状态的诱导条件模型,考察了温度、盐度和酸度3个因素对金黄色葡萄球菌细菌可培养数的影响,通过正交试验优化得到了VBNC状态的诱导条件,同时观察细菌可培养数的变化,建立了DNA结合染料叠氮溴乙锭(EMA)与qPCR技术相结合检测VBNC金黄色葡萄球菌的方法.实验结果表明:细菌可培养数受酸度的影响最大,VBNC状态的最佳诱导条件为菌液在含15%NaCl和0.3%乙酸的营养肉汤培养基中于4℃下培养12 d;通过正交试验诱导后的不可培养菌可由EMA-qPCR方法有效检出,其与qPCR法的Ct值(荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数)之差在1.29～8.56之间变化.; 余以刚田聪肖性龙陶文扬黎金霞吴晖; 关键词：金黄色葡萄球菌

单增李斯特菌非可培养状态的诱导与PMA-qPCR检测被引量：9: 2014年; 在9%(w/v)NaCl条件下,通过温度、pH两种因素诱导一株单增李斯特菌进入"活的非可培养"(viable but non-cuturable,VBNC)状态。通过LIVE/DEAD Baclight活菌检测试剂盒检测细菌总数与活菌数,比较单增李斯特菌状态及数量的差异与变化。结果显示,在2℃、pH6.0条件下单增李斯特菌活菌全部进入VBNC状态。用PMA-qPCR对经诱导的四份菌液进行检测,结果表明该方法能快速、准确地测出死菌背景下的活的单增李斯特菌。; 黄韵余以刚黄秀丽李晓凤肖性龙吴晖; 关键词：VBNC PMA 单增李斯特菌活菌

基于细菌酯酶活性的叠氮噻唑橙分子设计与特性验证: 2013年; 为了建立一种新型、高效的活菌检测技术,以细菌酯酶代谢活性为判断依据,设计合成了一种新型噻唑橙荧光染料——TOMA,其结构经核磁共振谱、高分辨质谱确证.对TOMA的细胞膜穿透性、酯酶敏感性及对DNA的PCR扩增的抑制作用3方面特性进行了初步验证.结果显示:10 mg/L的TOMA于室温、黑暗条件下与活的大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7混合孵育10 min后菌体发出强烈荧光,表明该分子能有效穿透细菌壁膜,并与核酸有良好的结合能力;用固定化脂肪酶对TOMA进行体外水解,水解率达83%,说明该分子的酯键能在相关酶作用下断裂;TOMA与实时荧光定量PCR联用时,该分子对细菌DNA扩增具有明显的抑制作用.以上结果证明TOMA分子设计基本达到预期目的.; 余以刚黄韵李晓凤肖性龙吴晖; 关键词：细菌酯酶 DNA扩增

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测被引量：15: 2013年; 为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养(VBNC)状态的复苏问题,采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌,尝试四种复苏方法,并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明:8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌48 h后复苏,同时PMA-qPCR能够有效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌,克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。; 田聪余以刚肖性龙吴晖赖富饶杨锡洪; 关键词：金黄色葡萄球菌 PMA 荧光定量PCR

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