北京市优秀人才培养资助(2012D003034000009)
- 作品数：8 被引量：38H指数：5
- 相关作者：李娜辛毅黄益民张兆光刘飒更多>>
- 相关机构：首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所首都儿科研究所更多>>
- 发文基金：北京市优秀人才培养资助国家自然科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化血管内皮细胞的实验研究被引量：7
- 2014年
- 目的探讨体外小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)的分离培养对其定向诱导分化为血管内皮细胞(VECs)的可行性。方法采用全骨髓贴壁法,分离骨髓间充质干细胞(MSCs)体外纯化培养并传代,倒置显微镜观察原代细胞形态变化,采用生长曲线法及3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法观察传代细胞生长特性。采用第3代mBMMSCs在内皮细胞生长培养基(EBM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导,观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析比较第3代mBMMSCs及诱导后细胞DNA周期、细胞免疫表型的变化;免疫细胞荧光技术分别检测CD31、vWF和CD34表达及摄取Di-lac-LDL结合FITC-UEA-1的功能特点;体外血管形成实验检测血管内皮细胞的功能。结果 mBMMSCs原代培养呈长梭形、漩涡状排列生长,P1、P2、P3细胞生长曲线及MTT法显示呈潜伏期、对数生长期及平台期生长。诱导后的部分细胞形态可见类似血管内皮样改变,呈多角形、短梭形、铺路石样排列生长;细胞周期分析显示,第3代mBMMSCs G0/G1期为86%,诱导分化后的细胞G0/G1期为92%,细胞DNA周期无明显差异;第3代mBMMSCs免疫表型结果显示为CD105、CD90、CD73、CD44阳性表达,而CD34、CD45、VEGF(CD309)、CD14阴性表达;诱导分化后的细胞VEGF(CD309)、CD34弱阳性表达,而CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD14阴性表达;细胞免疫荧光技术检测第3代mBMMSCs表面CD31、vWF和CD34阴性表达,不具有摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及形成血管管腔样结构;诱导后的细胞表达VECs特异性表面标志CD31、vWF和CD34,具有摄取Di-lac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及体外可形成血管管腔样结构。结论采用全骨髓贴壁法培养的mBMMSCs在体外具有定向诱导分化为VECs的潜能,成为血管组织工程理想的细胞来源。
- 辛毅李娜黄益民刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：骨髓间充质干细胞血管内皮细胞诱导分化小鼠
- 人脱细胞脐动脉支架与兔骨髓内皮祖细胞构建组织工程血管的实验研究被引量：7
- 2014年
- 目的:构建小口径组织工程生物血管并观察移植于兔颈动脉后的通畅情况。方法 :制备人脐动脉脱细胞支架,随机分为三组:Ⅰ.实验组:将兔皮肤成纤维细胞、下肢动脉平滑肌细胞和骨髓内皮祖细胞依次接种于纤维连接蛋白包被的血管支架上;Ⅱ.对照组:血管支架未经纤维连接蛋白包被,种植细胞种类同实验组;Ⅲ.裸支架组:未经处理的脱细胞裸支架。行HE染色观察种植细胞情况;免疫组化染色鉴定种植细胞的表型;电镜下观察人工血管内皮细胞间的连接状态。将人工血管分别移植于兔颈动脉,术后0h、2h、1d、2d、3d、7d、14d及30d后行血管超声检查,对三组移植血管通畅程度进行比较。结果:植入细胞后的人工血管动态培养2w后,Ⅰ组血管在倒置显微镜可见管腔内大量细胞附着、细胞呈密集环绕生长,HE染色结果显示:血管管腔内层均匀覆盖细胞;免疫组化染色其结果显示:管腔内层细胞高表达成熟内皮细胞表面标志CD34;扫描电镜观察血管腔内较为均匀的覆盖细胞,血管壁较为光滑呈膜性结构。Ⅱ组血管在倒置显微镜下和HE染色均未见附着的细胞;免疫组化染色显示管腔内层细胞不完整;扫描电镜观察血管腔内少量细胞覆盖,血管壁为不规则的纤维状结构。兔颈动脉移植术后立即行血管超声检测,结果显示实验组血管的内径为(3.97±0.2)mm,血流通畅,与裸支架组的(3.88±0.2)mm及对照组的血管内径(4.14±0.6)mm相比,差异无统计学意义(P>0.05);2h血管超声检测结果显示,实验组(3.81±0.7)mm与对照组(1.89±0.2)mm的血管内径有显著性差别(P<0.05),后者明显狭窄,出现血栓。30d后实验组血管内径(2.50±0.2)mm与移植0h比较显著狭窄(P<0.05)。结论:人脐动脉脱细胞支架与兔骨髓内皮祖细胞构建的组织工程生物血管移植于兔颈动脉可长期通畅。
- 汪川李京倖辛毅李娜刘硕张帆白辰
- 关键词：细胞种植血管移植
- 绿色荧光蛋白转基因小鼠不同源性间充质干细胞原代培养及生物学特性比较被引量：1
- 2014年
- 目的：探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠脐带和骨髓源性间充质干细胞（ MSCs ）的体外分离培养方法、生物学特性、表面标志及多向分化潜能。方法：应用Ⅱ型胶原酶消化培养法分离脐带MSCs及密度梯度离心法分离骨髓MSCs进行体外培养。在倒置显微镜下观察2种细胞的生长特点，运用生长曲线和MTT法检测其原代细胞增殖能力，台盼蓝法测定细胞传代成活率，采用流式细胞术测定2种第3代（ P3）细胞DNA周期及表面标志物的表达，并比较其向成脂细胞和成骨细胞的分化潜能。结果：酶消化法分离培养的脐带MSCs 1 d后，细胞贴壁呈成纤维形，2 d后呈漩涡状生长且增殖明显，3 d后达80％融合即可传代；应用密度梯度离心法分离骨髓MSCs，体外培养4 d后，细胞贴壁呈圆形、梭形和多角形生长，5 d后呈克隆样生长且增殖明显，7 d后达80％融合即可传代。原代培养的脐带MSCs生长曲线近似“S”形，骨髓MSCs 生长曲线较平缓；MTT法显示脐带MSCs在3～5 d增殖较明显，骨髓MSCs 7 d后细胞增殖较明显。2种P3细胞传代成活率均为96％以上，G0／G1期细胞均为85％以上，无明显差异（P＞0．05）；2种P3细胞CD44、CD90和CD105阳性率均为（60．7±2．3）％以上高表达，CD45、CD19、CD14和CD79a均为（25．6±4．8）％低表达，两者无明显差异（ P＞0．05）；2种MSCs在体外均具有向成骨细胞和成脂细胞分化的潜能，脐带MSCs向成骨及成脂细胞分化率均为90％以上，与骨髓MSCs的分化潜能比较有显著差异（ P＜0.05）。结论：脐带MSCs较骨髓MSCs具有较强的增殖能力及分化潜能。绿色荧光蛋白转基因小鼠的脐带MSCs可作为较好干细胞示踪的细胞源。
- 辛毅李娜张颖黄益民刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：脐带间充质干细胞生物学特性绿色荧光蛋白转基因小鼠
- 大鼠静脉多次注射人脐带间充质干细胞安全性的研究被引量：4
- 2015年
- 目的：观察多次静脉输注人脐带间充质干细胞（hu MSCs）对大鼠的毒性反应。方法：1贴块法培养hu MSCs;流式细胞仪鉴定第4代hu MSCs特异性表面抗原;标准试剂盒鉴定第4代hu MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能;2182~203g的SD大鼠分为对照组、0.9%氯化钠组和干细胞组,各8只,雌雄各50%。3干细胞组分别于第1、4和15天时经尾静脉注射（2.5×106）个/kg体质量的第4代hu MSCs,0.9%氯化钠组于同等时间注射与细胞悬液等量0.9%氯化钠液。4第3次注射转染RFP基因（中文）的hu MSCs后11天,腹主动脉取血,检测和比较血常规和生化指标;取脑、心、肺、肝及肾进行病理学检查;荧光显微镜观察器官组织中表达RFP的hu MSCs细胞分布情况,流式细胞仪检测骨髓中表达RFP的hu MSCs;ELISA检测血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10及IL-12含量。结果：1第4代hu MSCs特异性表面抗原CD73、CD90和CD105表达强阳性,纯度分别为98.7%、99.6%和98.6%,而CD34、CD45、CD11b、CD19、CD79a和HLA-DR的表达水平为阴性,CD14表达水平为23.1%;hu MSCs分化成脂细胞和成骨细胞的比例均为99%;2注射3次干细胞后实验动物全部存活,干细胞组部分血常规和生化指标与0.9%氯化钠组相比有差异,但与对照组相比,只有PLT明显降低、CHOL明显升高;3干细胞组脑、心、肺、肝、肾的形态和组织病理学无明显改变;（4）干细胞组的器官组织和骨髓中未检测到表达RFP的hu MSCs;（5）干细胞组血清IL-8水平明显升高。结论：多次尾静脉注射hu MSCs对大鼠没有明显的毒性反应。
- 张颖李娜林筝辛毅崔巍刘飒王忠陈雄赵颂军袁惠黄益民周玉杰罗毅张兆光
- 关键词：人脐带间充质干细胞毒性反应
- 人脐带间充质干细胞的原代培养及多向分化潜能的研究被引量：11
- 2013年
- 目的探讨人脐带间充质干细胞（hUCMSC）的体外分离培养鉴定方法及多向分化潜能。方法应用Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法及组织贴块培养法对hUCMSC进行体外培养。在倒置显微镜下观察不同方法获得的hUCMSC的生长特点；台盼蓝法测定细胞传代成活率；采用生长曲线、MTT法测定hUCMSC的增殖、流式细胞术（FCM）测定细胞周期变化及细胞免疫表型变化；采用相应试剂盒鉴定其向成脂细胞、成骨细胞的分化，采用免疫荧光细胞化学技术检测向成心肌样细胞的分化、采用荧光标记技术检测hUCMSC向血管内皮细胞的分化。结果酶消化法分离培养的细胞1d后，在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈圆形生长，4d后生长迅速呈长梭形，7d后由中心向周围生长且增殖明显，10d后达80％融合即可传代；贴块法培养的细胞7d后，可见细胞从组织块边缘长出，10d后细胞数量逐渐增多，16d后细胞生长迅速呈单层致密排列即可传代，细胞传代成活率均为96％以上。2种方法获得的第3代细胞生长曲线近似“S”形、MTr法显示3～5d细胞增殖较明显；酶消化法培养的细胞G0／G1期和s＋G2／M期所占比例分别为88．78％和10．21％，组织贴块法培养的细胞G0／G1期和S＋G2／M期所占比例分别为84．82％和13．87％，细胞DNA周期无明显差异；2种方法获得的细胞经FCM检测CD90、CD105、CD73阳性率均为99％以上为高表达；CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA—DR低表达；2种方法获得的细胞在体外诱导都能向成骨细胞、成脂细胞、成心肌样细胞及血管内皮细胞分化，其诱导阳性率均为90％以上。结论酶消化法和贴块法均可高效获得hUCMSC，与贴块法培养相比较，酶消化法能更有效的获得扩增迅速、细胞成分单一的细胞。
- 辛毅李娜黄益民崔巍刘飒许秀芳张兆光
- 关键词：人脐带间充质干细胞原代培养诱导分化
- 多次移植人脐带间充质干细胞对大鼠Th1和Th2比值的影响被引量：5
- 2013年
- 目的：观察多次静脉移植人脐带间充质干细胞（human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs）对大鼠Th1和Th2轴的影响.方法：①体外培养HUMSCs;流式细胞仪鉴定第4代hUMSCs表面抗原的表达；特异性诱导染色并鉴定第4代HUMSCs分化脂肪细胞和成骨细胞的潜能；②雄性SD大鼠30只,体质量182～203g,分为3组：空白对照组；0.9％氯化钠液组；干细胞移植组,每组10只.干细胞移植组：1次/w经尾静脉注射3.5×107/kg的HUMSCs,连续3次.第三次移植HUMSCs后11d,各组经腹主动脉取血,流式细胞仪检测T淋巴细胞的IFN-γ和IL-4阳性率.结果：3次注射干细胞后实验动物全部存活,干细胞组的Th1、Th2阳性率较0.9％氯化钠液组差异无统计学意义（P＞0.05）；Th1/Th2比值、血清IFN-γ和IL-4水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；干细胞组的心、脑、肺、肝及肾等脏器未发生病理改变.利用红色荧光蛋白转染的HUMSCs示踪,发现移植的HUMSCs大部分归巢于骨髓中.结论：多次尾静脉注射HUMSCs,未引起大鼠Th1、Th2细胞免疫和体液免疫系统的变化,Th1/Th2轴无明显改变.移植的HUMSCs能较长时间的存活于大鼠骨髓内,具有较好的免疫相容性.
- 李娜辛毅林筝孔晴宇张颖周玉杰黄益民张兆光
- 关键词：异种移植
- 间充质干细胞治疗心肌缺血性疾病的临床研究进展被引量：7
- 2013年
- 心肌缺血性疾病导致梗死区心肌细胞不可逆死亡,疤痕组织形成,心室重构,心功能降低最终导致心力衰竭。尽管现行心脏内外科治疗可以很大程度地降低了急性心肌梗死的病死率。然而并不能使梗死区梗死心肌细胞再生,导致心功能不可逆的降低。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是来源于骨髓和脐带,可以在体外被培养扩增,具有分化多种组织细胞能力的小细胞群。
- 李娜孔晴宇辛毅黄益民张兆光周玉杰
- 关键词：心肌梗死心肌缺血性疾病
- 构建高生物相容性干细胞心脏补片的研究
- 2015年
- 目的:去细胞化处理脐动脉构建生物支架,将小鼠脐带胶样组织间充质干细胞(MCS)种植到生物支架上构建心脏补片,移植到小鼠心肌梗死区域观察其生物相容性。方法:1联合应用胰酶和胶原蛋白酶处理小鼠脐带动脉组织构建生物支架;2体外分离并培养小鼠脐带MCS至第三代,种植到生物支架构建心脏补片;3移植到野生型小鼠皮下3天后观察免疫反应;4移植到小鼠心肌梗死区域,观察其与原位心肌的融合和血管新生。结果:脱细胞化处理后的脐带动脉组织在电镜观察下显示为富含多孔隙的纤维支架;荧光染色观察MSC种植到支架上深入生长到支架的内部并黏附生长;去细胞化处理未明显改变脐动脉组织的含水比例[(95.3±1)vs.(94.9±0.6),P>0.05];与对比组比较,去细胞化处理导致组织支架的断裂牵张力显著降低[(0.24±0.0)vs.(0.15±0.06)m Pa,P<0.05]。但是去细胞化处理未明显改变脐动脉组织的断裂变形率[(45±15)vs.(53±10)%,P>0.05];将裸支架和种植了干细胞的组织补片分别种植于C57野生小鼠的皮下,3日后切片染色,荧光显微镜下观察裸支架移植后局部CD+4淋巴细胞为(15±2.4)%,而干细胞补片内仅见少量CD+4的细胞浸润[(1±0.4)%,P<0.05]。将干细胞补片移植到小鼠急性心肌梗死区1周后,发现补片与原位心肌的融合性良好,补片内部有大量的新生血管生成。结论:成功构建心脏补片;移植到小鼠具有较高的生物相容性,并与原位心肌融合性好并有新生血管形成,为急性心肌梗死的干细胞治疗提供了实验依据。
- 李娜李佳辛毅张晓霞崔巍林筝黄益民周洁孔晴宇
- 关键词：间充质干细胞脐动脉生物相容性心肌梗死
