国家杰出青年科学基金(30228012)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
- 相关作者：李霞刘新平药立波张璟王立峰更多>>
- 相关机构：第四军医大学第四军医大学西京医院西安交通大学医学院第一附属医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 嵌合分子CblN/Grb2构建及其原核表达
- 2006年
- 目的构建CblN/Grb2嵌合分子,表达和纯化GST-CblN/Grb2融合蛋白,并考察嵌合分子CblN/Grb2在体外是否具有泛素连接酶活性。方法提取SKBR-3细胞的总RNA并反转录为cDNA,作为模板用PCR扩增Grb2基因的SH2片段;含有人全长CblcDNA的质粒pEFHACbl作为模板扩增Cbl基因N-端(CblN);用重叠延伸PCR方法,在CblN内部SH2两端引入BamHⅠ和EcoRV酶切位点并克隆入pcDNA3·1(+)。再以Grb2基因的SH2置换CblN的SH2即成为pcDNA3·1(+)-CblN/Grb2;以其为模板,通过PCR方法扩增CblN/Grb2并将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达GST-CblN/Grb2融合蛋白并用GlutathioneSepharose4B进行纯化;通过体外泛素化实验检测GST-CblN/Grb2是否具有泛素连接酶活性。结果成功构建了pGEX-4T-2-CblN/Grb2融合表达载体;在大肠杆菌DH5α中表达了GST-CblN/Grb2融合蛋白并获得了纯化蛋白;体外泛素化实验表明GST-CblN/Grb2具有泛素连接酶活性。结论GST-CblN/Grb2的表达、纯化及其体外活性的鉴定为进一步研究该嵌合泛素连接酶对HER2阳性肿瘤细胞生长的影响奠定了基础。
- 李霞张健王立峰刘娜刘新平药立波
- 关键词：重叠延伸PCR重组融合蛋白质类
- 人cbl基因真核表达载体的构建及表达被引量：3
- 2004年
- 目的 :构建带有flag标签的人cbl基因真核表达载体 ,并检测其在真核细胞中的表达 .方法 :以含有人全长cblcDNA的质粒pEFHAcbl为模板 ,采用PCR方法扩增cbl基因 ,并在其N 末端带上含 2 4bp的flag标签 ,克隆到 pGEM Teasy载体并测序 ,再亚克隆至真核表达载体 pcDNA3 1(+) ,酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS 7细胞 ,Westernblot检测flag cbl在细胞中的表达 .结果 :测序证实以pEFHAcbl为模板获得的flag cbl融合基因的序列以及读框全部正确 ;重组质粒 pcDNA3 1(+) flag cbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段 ;脂质体法转染COS 7后检测到预期目的蛋白的表达 .结论 :成功构建了N 末端带flag标签的cbl真核表达载体 ,并使其在真核细胞COS 7中表达 .
- 李霞张璟苏金王立峰刘新平刘云才药立波
- 关键词：CBL聚合酶链反应克隆分子基因表达
- cblN/Zap嵌合分子的构建及其对Jurkat细胞TCRζ的下调
- 2005年
- 目的:构建cblN/Zap嵌合分子,稳定转染Jurkat细胞后观察对细胞TCRζ的影响。方法:提取Jurkat细胞的总RNA并反转录为cDNA,以其作为模板用PCR方法扩增Zap基因的SH2片段。以含有人全长cblcDNA的质粒pEFHAcbl作为模板扩增cbl基因的N端(cblN),并在其N末端带上含24bp的flag标签。用重叠延伸PCR法,在cblN基因内部的SH2两端引入BamHI和EcoRV酶切位点并克隆入pcDNA3.1(+)中。再以Zap基因的SH2置换cblN基因的SH2,即成为pcDNA3.1(+)cblN/Zap。酶切鉴定及测序正确后,采用脂质体法稳定转染Jurkat细胞,用RTPCR和Westernblot鉴定flagcblN/Zap的表达,用Westernblot检测其对细胞TCRζ表达的影响。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)flagcblN/Zap经酶切后可产生与理论预期长度相符的片段。且测序证实其序列正确。脂质体法稳定转染Jurkat细胞后,检测到目的基因在RNA和蛋白水平的表达。表达的cblN/Zap可下调Jurkat细胞的TCRζ。结论:重构嵌合分子cblN/Zap可下调Jurkat细胞的TCRζ。
- 李霞沈岚张璟刘新平刘云才药立波
- 关键词：CBL重叠延伸PCRJURKATJURKAT细胞
- 图像重建联合立体定向放射治疗肺癌36例
- 2004年
- 目的 :研究用图像重建方法放射治疗肺癌的临床疗效 .方法 :对 36例肺癌患者采用CT定位 2mm层厚连续扫描并通过计算机进行图像重建 ,确定临床靶体积 (CTV) ,计划靶体积 (PTV)及受累器官体积的照射量 -体积直方图 ,然后应用德国Leibinger的立体定向系统和Varian 6 0 0c或 2 30 0EX加速器进行放射治疗 .采用中等剂量 ,每次 5～ 7Gy ,每日 1次 ,连续治疗 5～ 8次 .结果 :36例肺癌无死亡病例 ,Karnofsky(KPS)评分放疗前 5 0～ 90 (平均 6 7 2 )分 ,放疗后 6 0～ 10 0 (平均 79 4 )分 .随访 6～ 36 (平均 18)mo,通过CT复查 ,按照实体瘤疗效标准 :完全缓解 (CR) 6例 ,部分缓解 (PR) 2 3例 ,无变化(NC) 3例 ,进展 (PD) 4例 ,肿瘤控制有效率 (CR +PR) 80 .6 %(2 9/ 36 ) .结论 :图像重建联合立体定向放射治疗肺癌的近期疗效良好 .
- 范风云张丙芳陆军魏文胜石梅南克俊
- 关键词：肺肿瘤立体定位技术放射疗法
