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ARMET的原核表达及其单克隆抗体的制备被引量：3: 2009年; 目的制备抗人ARMET(arginine-rich,mutated in early stage of tumors)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法将pET28a-ARMET转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,用预装好的Ni-beads柱进行纯化,通过SDS-PAGE电泳及考玛斯亮蓝染色方法判断融合蛋白的表达量及纯度。将纯化的ARMET免疫雌性BALB/c小鼠后采用淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌抗ARMET杂交瘤细胞株。体内诱生腹水法制备mAb,间接ELISA法测定其效价及抗体亚型,辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb。用免疫荧光双标及Western blot法对抗体的特异性进行了鉴定。结果获得了纯度较高、浓度较高的融合蛋白;建立了7株稳定分泌特异性抗ARMET mAb的杂交瘤细胞株,诱生腹水法获得的抗体效价在1×10-5～1×10-7之间,且均有较好的特异性。结论已成功制备出抗ARMET mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究奠定了基础。; 王法财王海萍李琪方圣云沈玉先

内质网应激与神经元退行性变被引量：10: 2007年; 内质网(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白质修饰、折叠和钙贮存的场所。ER内未折叠或错折叠蛋白积聚和钙平衡失调均可导致ER应激。早期的ER应激或未折叠蛋白反应,是一种自身代偿过程,对细胞起到保护作用,而长期、严重的ER应激则会诱导细胞凋亡及死亡。研究发现,ER应激在许多神经退行性疾病的病理机制中起重要作用。然而,确切的机制目前仍不清楚。该文就ER应激在神经元退行性变中的作用作一综述。; 冯利杰王海萍沈玉先; 关键词：内质网应激神经退行性疾病未折叠蛋白反应细胞凋亡

GFP-ATZ在HEK 293T中的表达及其细胞毒作用被引量：1: 2010年; 目的构建具有绿色荧光蛋白(GFP)标签的α1抗胰蛋白酶Z突变型(ATZ)的真核表达载体,在人胚胎肾细胞(HEK293T)中验证表达情况及检测其对细胞的影响。方法以pcDNA3.1-zeo+-ATZ质粒为模版,设计引物,PCR扩增出ATZ的cDNA序列,插入真核表达载体pEGFP-C1中,构建带有GFP标签的ATZ真核表达载体pEGFP-C1-ATZ,脂质体转染体外培养的HEK293T细胞,Western blot、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测GFP-ATZ在细胞中的表达、分布情况及其对细胞形态和分裂的影响。结果 ATZ片段成功插入pEGFP-C1表达质粒,在表达GFP的HEK293T细胞内,绿色荧光呈弥散的全细胞分布,而表达GFP-ATZ的细胞绿色荧光分布于细胞质内;Western blot结果显示特异性条带,分子量大小与GFP-ATZ预期相符;GFP-ATZ的过度表达引起细胞出现不同程度的形态改变、分裂障碍、聚集体出现甚至死亡。结论成功构建了具有绿色荧光标记的ATZ真核表达载体,GFP-ATZ的表达具有细胞毒性。; 王海萍王法财沈玉先; 关键词：转染

氯化钆对大鼠腹腔巨噬细胞表达CD68的影响被引量：6: 2009年; 目的观察氯化钆(GdCl3)对大鼠腹腔巨噬细胞(PMΦ)表达CD68是否有抑制作用。方法取正常大鼠PMΦ体外培养,用不同浓度的GdCl3处理PMΦ;采用弗氏完全佐剂(FCA)诱导大鼠佐剂性关节炎(AA)模型并尾静脉注射GdCl3。采用免疫荧光双标、Western blot法检测PMΦ活化标记物CD68的表达情况。结果在一定的浓度范围内,GdCl3可抑制体外培养的正常大鼠PMΦ中CD68的表达,以5×10-6mol/L浓度抑制效果最明显。大剂量的GdCl3对细胞有明显的毒性作用,表现为细胞的形态和核发生改变,并可诱导内质网(ER)应激相关蛋白ARMET的表达。对于AA大鼠活化的PMΦ,体内注射GdCl3(10mg/kg)可使部分CD68阳性的PMΦ转阴,同时促进这些阴性细胞的分化;GdCl3并可诱导部分活化的PMΦ凋亡。结论GdCl3可以抑制大鼠PMΦ中CD68的表达及诱导活化的PMΦ凋亡,这可能是GdCl3抑制PMΦ活化的机制之一。; 黄学桂王法财王海萍路锦涛沈玉君沈玉先

重组人tau蛋白对神经细胞的毒性作用被引量：3: 2009年; 目的观察重组人tau蛋白对神经来源的细胞株SH-SY5Y及体外原代培养的神经元是否有毒性作用。方法将原核表达纯化的重组人tau蛋白加入SH-SY5Y细胞和原代培养的大鼠神经元培养液中,通过观察细胞形态、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖活性、TUNEL染色检测细胞凋亡、免疫荧光染色观察凋亡诱导蛋白CHOP及内质网应激上调蛋白ARMET的表达情况研究tau蛋白对神经细胞生长、增殖和凋亡的影响。结果随着tau蛋白作用时间的延长,细胞胞体逐渐变圆,突起减少甚至消失,染色质聚集,部分神经元出现了凋亡。MTT检测结果显示tau蛋白可抑制细胞的增殖。同时发现,细胞外的tau作用可诱导内质网应激标志性蛋白CHOP和ARMET的表达。结论重组人tau蛋白对神经细胞有毒性作用,该作用可能部分与tau诱导的内质网应激有关。; 张晶晶王法财王海萍梁燕沈玉先; 关键词：原核细胞

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国家自然科学基金(30572219)