福建省科技重大专项(2002F013)
- 作品数：12 被引量：110H指数：6
- 相关作者：张军夏宁邵顾颖王颖彬罗文新更多>>
- 相关机构：厦门大学北京万泰生物药业股份有限公司更多>>
- 发文基金：福建省科技重大专项博士科研启动基金福建省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 亲和层析法用于噬菌体抗体库的筛选被引量：4
- 2006年
- 本研究报道一种基于固定化金属亲和层析(IMAC)的噬菌体抗体库液相筛选方法。将纯化的带有His标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His标签与介质结合,然后通过充分洗涤去除非特异性噬菌体抗体,最后将特异性噬菌体抗体洗脱下来,感染TG1,进行下一轮筛选。整个筛选过程中抗原与抗体的结合在液相中完成,不仅消除了固相介质对抗原表位的影响,也更有利于噬菌体抗体与抗原的充分作用。将此方法应用于HEV NE2蛋白特异性人源噬菌体抗体的筛选,抗原竞争ELISA,阳性血清阻断,可溶性单链抗体表达检测及测序结果表明,最终获得2个特异性人源抗体。
- 陈瑛炜罗文新王明桥王晋李利峰袁权张军夏宁邵
- 关键词：噬菌体抗体库
- 颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性被引量：37
- 2004年
- 过去的研究发现大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒 (HEV)衣壳蛋白ORF2的aa3 94_60 6片段NE2可以形成同源多聚体 ,并具有良好的免疫保护性 ,但纯化后的免疫原性较弱。这里表达了 3个NE2蛋白的N端延伸突变体 ,发现对应于ORF2aa3 68_60 6的重组蛋白HEV 2 3 9在体外可以形成颗粒性抗原。HEV 2 3 9抗原颗粒与戊肝患者血清反应性良好 ,对中和性单克隆抗体 8C11的反应性与NE2抗原相当 ,而对另一中和性单克隆抗体 8H3的反应性较NE2抗原有显著提高 ,表明HEV 2 3 9抗原颗粒具有比NE2更好的抗原性。纯化后的HEV 2 3 9抗原颗粒直径约为 15～3 0nm。铝佐剂吸附的HEV 2 3 9免疫Balb c小鼠的半数有效剂量 (ED5 0 )在 0 0 8～ 0 2 5μg之间 ,而同样以铝佐剂吸附的NE2抗原 60 μg剂量免疫的抗体阳转率仅 2 5% ,表明HEV 2 3
- 何志强张军李少伟林鉴刘如石陈毅歆王颖彬夏宁邵
- 关键词：戊型肝炎病毒衣壳蛋白原核表达抗原性免疫原性
- 戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体的相互作用结构域被引量：12
- 2004年
- 为了探讨戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体形成的关键区域和相互作用结构域 ,以及二聚体形成与主要天然中和表位的形成之间的关系 ,通过末端缺失、定点突变技术研究戊型肝炎病毒 (HEV)ORF2的aa394_aa6 0 6片段NE2的聚合现象 ,发现其C端的aa5 97_aa6 0 2 (AVAVLA)疏水区是该片段同源聚合的核心区域 ,提高该区域氨基酸的亲水性将妨碍聚合现象的发生 ;半胱氨酸化学交联实验表明NE2形成同源二聚体时 ,aa5 97在空间位置上相接近 ,处于可生成化学键的距离 ,提示所处区域为疏水聚合的作用结构域 ;通过Blast程序估算核心区域的天然突变率 ,发现其疏水性高度保守 ;N端缺失实验表明 ,至少 6 5个氨基酸既不影响同源聚合也不直接参与主要的天然中和表位的形成 ,但可协助中和表位构象的形成 ,而这种协助作用可被ORF2的末端肽段所代替。aa5 97_aa6 0 2 (AVAVLA)疏水区为戊肝病毒衣壳组装的第一步骤的核心区域 ,并与重要的天然中和表位的形成直接相关 ,从而为戊肝病毒疫苗的研究提供更详细的信息。
- 李少伟何志强王颖彬陈毅歆刘如石林鉴顾颖张军夏宁邵
- 关键词：戊型肝炎病毒基因突变
- 抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达被引量：1
- 2004年
- 通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3 1/Hygro和pcDNA3 1(+)质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞。RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Westernblot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用。8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础。
- 罗文新李利峰许辰煜程通管宝全张军夏宁邵
- 关键词：嵌合抗体戊肝重链可变区CHO细胞轻链
- 戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体的鉴定被引量：22
- 2003年
- 阻断实验发现,用戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白重组抗原制备的8株抗HEV单克隆抗体(mAb),分别识别3个构象表位和2个线性表位。用抗体捕获反转录PCR方法证实,其中识别2个构象表位的3个mAb可以直接捕获HEV颗粒,表明这2个表位位于HEV颗粒的外表面。识别这两个表位的mAb8C11和8H3均可中和HEV对恒河猴的致病性和感染性。mAb8C11缩短排毒时间的效应较明显,而mAb8H3延迟机体抗HEV抗体阳转时间的效应较明显。二者的中和效应具有较明显的协同作用。中和单抗8C11、8H3对戊肝不同感染时期的血清均有显著阻断作用,Fab片段的阻断作用与完整抗体类似,表明这两个mAb对应的中和表位是HEV体液免疫应答的优势表位。
- 顾颖葛胜祥黄果勇李少伟朱子恒何志强陈毅歆王颖彬张军夏宁邵
- 关键词：戊型肝炎病毒单克隆抗体中和表位
- 戊型肝炎病毒衣壳蛋白中和表位间的构象诱导被引量：3
- 2004年
- 重组蛋白NE2包含了戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白(pORF2)的aa394～606片段。在NE2上已鉴定出了2个HEV中和表位,并获得了3个识别中和表位的单克隆抗体(MAb)8C11、13D8和8H3。这3个MAb间的交叉阻断ELISA实验发现,8C11和13D8可以彼此完全阻断,8H3对8C11和13D8均不能阻断,而8C11非但不能阻断8H3,反而显著增强了8H3与抗原的结合。用生物传感器进行的抗体与抗原结合的动力学分析也证实了这一现象。这些结果提示,在NE2上8H3表位区域受到抗原上某些结构的掩盖,而8C11与NE2的结合引起了抗原空间结构的改变,导致了掩盖8H3表位的结构的去除和8H3表位的充分暴露。免疫捕获RT PCR发现,8C11同样可以显著增强8H3对天然HEV病毒的捕获能力,提示这种结合诱导的衣壳蛋白空间构象改变在天然HEV病毒颗粒上同样存在。
- 张军顾颖欧山海王颖彬叶祥忠林鉴葛胜祥夏宁邵
- 关键词：戊型肝炎病毒衣壳蛋白中和表位构象单克隆抗体
- 多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用被引量：5
- 2006年
- 目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。
- 王晋罗文新李利峰陈瑛炜王明桥张军夏宁邵
- 关键词：单链抗体多样性
- 大肠杆菌重组颗粒性戊型肝炎疫苗对恒河猴的免疫保护被引量：13
- 2004年
- 大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒 (HEV)衣壳蛋白ORF2片段HEV 2 39重组蛋白颗粒 ,经铝佐剂吸附后 ,分别以5 μg、1 0 μg和 2 0 μg剂量免疫恒河猴 ,2 8天时以相同剂量加强免疫 1次 ,3周后分别以不同病毒滴度的基因Ⅰ型或基因Ⅳ型HEV静脉攻击。结果 ,加强后 3周 ,3个免疫剂量组猴的抗体几何平均滴度分别为 1∶2 71 75、1∶344 0 9、1∶4 16 0 7,以世界卫生组织参比血清定量 ,则分别为 1 0 98IU/ml,1 35 7IU/ml、1 72 4IU/ml。每个剂量免疫组及对照组各有 3只猴接受 1 0 7病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染 ,对照组 3只猴均被成功感染 ,2只出现肝炎 ;2 0 μg免疫组 3只猴均未被感染 ;1 0 μg和 5 μg免疫组各有 2只猴未被感染 ,另 1只猴出现短暂感染 ,免疫猴均未出现肝炎。 3个剂量免疫组及对照组另外 3只猴 ,接受 1 0 4病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染 ,对照组 3只猴均被感染 ,1只出现肝炎 ;而免疫猴均未被感染 ,也未出现肝炎。 3只 1 0 μg免疫猴和 3只对照猴分别接受 1 0 7病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染 ,对照组均被感染并出现肝炎 ,而免疫组均未出现肝炎 ,有 2只未被感染 ,另 1只被短暂感染。另有 3只 1 0 μg免疫猴和 3只对照猴分别接受 1 0 4病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染 ,对照组均被感染 ,而免疫组均未被感染。这些结果表明
- 张军李益民李少伟欧山海黄果勇何志强葛胜祥鲜阳凌逄淑强夏宁邵
- 关键词：戊型肝炎疫苗原核表达恒河猴保护率
- 噬菌体抗体库固相筛选条件的初步研究被引量：4
- 2006年
- 目的:探讨噬菌体抗体库的固相筛选条件,为筛选方案的设计提供实验依据。方法:利用多种针对HEVNE2蛋白的特异性噬菌体人源抗体和非特异性噬菌体人源抗体,对噬菌体抗体与抗原的结合时间、抗原包被的浓度、洗涤强度和洗脱方式等多种筛选的条件进行初步探索。结果:阳性噬菌体抗体与抗原反应1min,就可较好结合,洗涤次数为20～30次、洗涤液的pH为5时,筛选得到的阳性率最高。包被抗原的浓度对筛选的阳性率没有明显影响,用10mg/L抗原竞争洗脱60min,可得到较高的阳性率。结论:噬菌体抗体库的筛选是一个非常复杂的过程,其中的各个条件之间有着密切的联系,应该根据具体情况进行调整。
- 王明桥罗文新陈瑛炜袁权王晋张军夏宁邵
- 关键词：噬菌体抗体库
- 基于多聚化重组抗原的检测戊型肝炎病毒IgM与IgG抗体的ELISA的建立及初步评估被引量：38
- 2003年
- 建立并评估分别检测戊型肝炎 (戊肝 )病毒IgM与IgG抗体的捕获法及间接法ELISA。以原核表达的多聚化重组HEV蛋白为抗原 ,建立戊肝捕获法IgMELISA(E2 -IgM )和间接法IgGELISA(E2 -IgG)。利用 2 9只实验感染猴系列血清及多份临床急性肝炎血清、正常人血清以及单克隆抗体评估所建立的方法的敏感性与特异性 ,并与商品化试剂 (Genelabs公司抗 -HEVIgG和IgM试剂 ,GL -IgG/GL -IgM )进行比较。 2 9只恒河猴E2 -IgM和E2-IgG的阳转率均为 10 0 % ,其中 75 %在感染后 4周内阳转 ,均早于ALT异常时间。E2 -IgM持续 2～ 14周 ,平均6周 ;E2 -IgG在 70周时仍无一阴转。GL -IgG阳转率为 79 3% ( 2 3/ 2 9) ,多数晚于ALT异常时间 ,平均持续约18周 ,但最长为 1只在感染后 70周时仍为阳性。用E2 -IgM试剂盒检测 92 8份正常人血清 ,仅 2份OD值略高于0 2。检测 5 10份临床急性肝炎血清 ,可明显将其区分为 2个部分 ,一个部分OD值小于 0 2 ,其OD值分布与正常人相似 ;另一个部分OD值大于 0 4,共 131份 ,其中 10 9份大于 1 0。可能分别对应于急性肝炎中的非戊肝患者和戊肝患者。 119份非甲～丙急性肝炎中 ,E2 -IgM阳性 5 7份 ,GL -IgM阳性 2 9份 (E2 -IgM均阳性 )。 5 0 6 0份普通人群血清的E2 -IgGOD值在 0 2以下 。
- 葛胜祥张军彭耿黄果勇何志强顾颖朱子恒吴文翰夏宁邵
- 关键词：戊型肝炎IGMIGG
