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原核高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的特性及应用被引量：4: 2007年; 从已构建的PRRSV ORF7重组质粒pUCm-T-ORF7中用PCR扩增ORF7基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-ORF7并转化大肠杆菌。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,成功表达了谷胱苷肽转移酶(GST)融合的核衣壳蛋白(N),重组N蛋白表达量约为菌体总蛋白的35%,主要以可溶的形式存在,且能形成同源二聚体。重组N蛋白经谷胱苷肽凝胶(glutathione sepharose 4B)亲和层析后得到高度纯化,并将该蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法。利用该方法对某猪场76份猪血清进行检测并将结果与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果作比较,2种方法的总符合率达93.4%,检测结果之间差异不显著(P>0.05)。结果表明大肠杆菌表达的重组GST融合N蛋白具有良好的抗原性,因而有望利用该重组蛋白开发为试剂盒应用于临床PRRSV抗体的检测。; 吴国平郭川曹敏杰刘冰心梁银龙苏文金; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白同源二聚体间接ELISA

鸡白细胞介素2基因的克隆、原核表达及功能研究被引量：4: 2006年; 以RT-PCR法从鸡脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素2编码基因,通过双酶切、连接步骤克隆进原核表达载体pQE30及pGEX-4T-3,构建了鸡白细胞介素2基因的重组原核表达质粒pQE30-chIL-2及pGEX-chIL-2.重组质粒转化大肠杆菌JM109后经诱导表达,分别得到两种表达产物.以SDS-PAGE和Westernblot检测确认表达产物为带6组氨酸标签及GST蛋白的融合鸡白细胞介素2,分子量分别为16 kDa及39.5 kDa.表达蛋白与抗鸡白细胞介素2单抗均有良好的免疫结合性,进一步证实为鸡白细胞介素2.表达产物经过纯化复性后,具有明显促进鸡脾淋巴细胞增殖的作用.; 郭川郑忠辉吴国平林由苏文金曹敏杰; 关键词：鸡白细胞介素2 克隆原核表达免疫印迹

猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析被引量：2: 2006年; 根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了1对特异性引物P1/P2,用RT-PCR扩增了PRRSV福建毒株FJ-1和FJ-2的全长核衣壳蛋白基因(ORF7),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,提取阳性重组质粒进行序列测定与分析.结果表明:FJ-1和FJ-2毒株ORF7基因均为372 bp,编码123个氨基酸,与美洲型参考毒株VR-2332及欧洲型参考毒株LV的核苷酸同源性分别为95.16%,94.35%和61.40%,60.65%,其推导的氨基酸同源性分别为95.93%,95.12%和56.49%,55.73%.研究表明,福建流行的FJ-1和FJ-2属于美洲型PRRSV毒株.; 吴国平刘冰心郭川曹敏杰苏文金; 关键词：PRRSV ORF7

RT-PCR快速检测猪繁殖与呼吸综合征临床组织样品的研究被引量：26: 2004年; 根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列 ,在其核衣壳蛋白基因 (ORF7)保守区设计了一对跨幅约 380bp的特异性引物N1/N2 ,对已知PRRSVJK10 0 1毒株和PRRS临床病料进行RT PCR扩增 ,均扩增出约 380bp的特异片段。用此方法检测 5份疑似PRRS病例肺组织病料 ,结果均为阳性 ,对 2个阳性样品扩增产物进行克隆、测序 ,全长均为 372bp ,与PRRSVVR 2 332毒株ORF7同源性为 95%,证实为PRRSV的核衣壳蛋白基因。结果表明 ,建立的RT PCR检测PRRS临床组织病料特异、快速。; 吴国平郭川曹敏杰苏文金; 关键词：RT-PCR检测繁殖与呼吸综合征

猪呼吸道冠状病毒核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达被引量：1: 2005年; 以RT-PCR法从猪呼吸道冠状病毒(PRCV) 感染的ST细胞中得到核衣壳蛋白(N蛋白)cDNA, 并以此为模板利用PCR技术完成了N蛋白的基因扩增. 通过双酶切、连接、转化等过程构建了猪PRCVN蛋白基因的重组原核表达质粒, 表达产物经SDS PAGE、Westernblot检测被确认为GST融合的N蛋白. 表达蛋白与PRCV阳性血清间有良好的免疫结合性.; 曹敏杰郭川吴国平翁凌苏文金; 关键词：猪呼吸道冠状病毒 N蛋白克隆

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达被引量：3: 2006年; 根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.; 郭川吴国平郑忠辉苏文金曹敏杰; 关键词：PRRSV ORF5 原核表达

PRRSV福建流行毒株结构蛋白基因之克隆分析: 2008年; 对福建省流行的PRRS病毒FJ-1的结构蛋白基因进行了克隆、测序．FJ-1结构蛋白基因序列长3188个核苷酸，包含7个开放阅读框（ORF）．将FJ-1结构蛋白基因与国内外已发表的18个报道全长结构蛋白基因的PRRSV毒株进行核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，发现：其与17个美洲型毒株核苷酸同源性达到89．7％～92．4％，推定各个ORF编码氨基酸的同源性在85．6％～98．6％之间；而与欧洲型毒株Lelystad核苷酸同源性为54．9％，推定各个ORF编码氨基酸同源性为53．2％～78．2％．遗传进化树分析表明FJ-1与美洲型毒株进化距离近，而与欧洲型毒株进化距离远．从分子水平上证明了福建省流行的PRRS病毒属于美洲型毒株．; 吴国平苏文金曹敏杰; 关键词：猪繁殖和呼吸综合征病毒结构蛋白基因

II型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达与初步应用被引量：1: 2006年; II型猪圆环病毒(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMW S)的重要病原.本研究用PCR以构建的PCV2ORF2重组质粒pBS-T-ORF2为模板,扩增截短的ORF2(tORF2)基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-tORF2并转化大肠杆菌BL21(DE3).经SDS-PAGE及W estern b lot鉴定,成功表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的tORF2,重组蛋白分子量约为45ku,表达量约为菌体总蛋白的20%,重组蛋白具有良好的免疫学活性.用tORF2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)阳性猪血清进行W estern b lot检测,有4份(20%)血清显示PCV2抗体阳性,说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象.本研究初步证明表达的tORF2重组融合蛋白可以应用于临床检测.; 吴国平郭川刘冰心梁银龙苏文金曹敏杰; 关键词：原核表达

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福建省科技攻关计划(2003N083)