国家自然科学基金(30340025)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 相关作者：洪涛王健伟屈建国郭岚于修平更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心山东大学卫生部更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- SARS病毒S蛋白片段与细胞结合作用分析
- 2005年
- 目的研究SARS冠状病毒(SARSCoV)S蛋白片段与SARSCoV敏感细胞Vero的相互作用,明确S蛋白的受体结合位点。方法在E.coli中表达S蛋白第260～600位氨基酸(S260600)和397～796位氨基酸(S397796)片段,通过Westernblot对蛋白表达进行确认,用NiSepharose螯合层析对重组蛋白进行纯化。将纯化的S260600和S397796蛋白与Vero细胞4℃共同孵育1h后,先后与SARS患者血清及FITC标记的抗人IgG作用,通过流式细胞仪检测蛋白与细胞表面受体的结合情况。结果成功构建了原核表达质粒pET30a/S260600和pET30a/S397796,并表达、纯化出S260600和S397796重组蛋白。分别用SARS患者血清和抗6×His单克隆抗体进行Westernblot检测,证实重组蛋白得到正确表达。流式细胞仪分析显示S260600和S397796重组蛋白均可与Vero细胞发生结合,但S397796的结合力要弱于S260600。同时发现S260600重组蛋白与SARSCoV非敏感细胞NIH3T3细胞不能结合,进一步证明S260600重组蛋白与Vero细胞表面受体的结合是特异性的。结论重组蛋白S397796和S260600具有受体结合能力,尤其S260600包含了重要的受体结合位点,对进一步研究介导SARSCoV感染的细胞表面受体、开展疫苗和抗病毒药物的筛选均具有重要意义。
- 魏海燕王健伟欧阳晶王彦斌屈建国赵蔚明洪涛
- 关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒科蛋白质S
- SARS-CoV在Vero细胞培养中的多形性特征
- 2006年
- 为揭示SARS相关冠状病毒（SARS—associated coronavirus，SARS-CoV）的复制特点，并探讨该病毒的致病机制，利用负染电子显微镜（EM），超薄切片EM和免疫EM技术研究了SARS-CoV在Vero细胞E的形态学特征。结果显示，成熟病毒颗粒多为圆形或椭圆形，直径80～120nm，包膜上有放射状排列的纤毛样突起，长约20nm，基底窄。此外可见哑铃形、肾形及“钉子样”等多形性成熟病毒颗粒，这屿颗粒能与病人恢复期血清和抗S蛋白抗体反应。细胞内病毒颗粒多位于包涵体内，呈显著的多形性，直径为20～400nm，其形状可分为：①圆形、肾形或椭圆形；②管样结构；③不规则形，如三角形、哑铃形等，另外可见一种特殊的分枝样颗粒。颗粒电子密度不一，有实心和空心两种，其中守心颗粒周边的电子密度高。还观察到螺旋形的病毒核衣壳结构。
- 王健伟任丽丽屈建国孙异临陈良标洪涛
- 关键词：形态学特征细胞培养
- SARS病毒刺突蛋白与TAP标签在Vero细胞内的融合表达研究被引量：1
- 2005年
- 目的:探讨SARS冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)与钙调蛋白结合肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)-蛋白A串连亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)标签在Vero细胞内的融合表达及亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。方法:从质粒pGEM-4Z-S中扩增S片段,在5'端加入Kozak序列,并与TAP标签基因共同插入pcDNA3.1(-)中,构建出真核表达载体pcDNA3.1-S-TAP(C)。将构建好的质粒瞬时转染Vero细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光及Western-blotting技术检测融合蛋白的表达及亚细胞定位。结果:成功构建出真核表达载体pcD-NA3.1-S-TAP(C),瞬时转染Vero细胞后S-CBP-蛋白A融合蛋白[S-TAP(C)]得到表达,重组痘苗病毒vTF7-3可有效增强该融合蛋白的表达水平,且检测到S-TAP(C)融合蛋白表达于细胞膜上。结论:S蛋白与TAP标签融合蛋白表达于细胞膜上,且vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。
- 郭岚王健伟韩金祥于修平洪涛
- 关键词：SARS冠状病毒刺突蛋白VERO细胞
