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猪繁殖与呼吸综合征病毒SCMS株MN蛋白基因的克隆与序列分析: 2006年; 根据GenBank中登录的美洲株ATCC VR-2332的MN蛋白基因序列,利用Oligo6.0设计一对特异性引物,以抽提的PRRSV-SCMS病毒感染细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出长约1.0 kb的基因片段,将其克隆入pMD 18-T载体,测序结果显示SCMS MN基因全长886 bp,包含完整的MN基因的开放阅读框,共编码297个氨基酸。PRRSV-SCMS MN基因序列与VR2332和LV株进行同源性分析结果显示,PRRSV-SCMS与VR2332和LV株之间的核苷酸序列同源性分别为99.7%和61.6%,根据M基因推导的氨基酸序列同源性分别为98.9%和78.7%,根据N基因推导的氨基酸序列同源性分别为100%和52.8%。结果表明,SCMS地方分离株与VR2332株在基因型上具有更近的亲缘关系,推测本次分离的PRRSV属于美洲型。; 袁孟伟颜其贵郭万柱; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒克隆

猪细小病毒SC1株非结构蛋白NS1基因的原核表达及PPA-NS1-ELISA的初步建立被引量：4: 2007年; 含有猪细小病毒SC1株非结构蛋白NS1基因的重组质粒pPNS1通过EcoR+Hind双酶切后,回收NS1基因,将其亚克隆进原核表达载体pET30a(+)中,构建了重组表达质粒pET-NS1,转入表达宿主菌BL21中,通过IPTG的诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组NS1蛋白高效表达,以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的26.7%。并确定了NS1蛋白的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.6mmol/L,诱导时间为3h。Westernblotting检测表明,表达产物具有良好的免疫原性。重组蛋白经纯化后作为抗原,包被酶标板,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗,建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-NS1-ELISA)。结果表明,抗原最佳包被质量浓度为31.3mg/L,血清最佳稀释度为1∶40。阳性标准初步定为:待检血清D490>0.32,且待检血清D490/阴性血清D490>2.0。; 陈进会郭万柱殷华平颜其贵徐志文王印罗燕王小玉; 关键词：猪细小病毒 NS1基因

猪传染性胃肠炎病毒SC-1株的分离与基因7的克隆分析被引量：4: 2007年; 从四川某猪场采集疑似病例的腹泻粪样中分离到1株病毒,该病毒经过ST细胞传代培养盲传至第4代时出现病变。通过荧光抗体染色、病毒中和试验、TCID50试验、核酸类型鉴定,结合样品正染后在电镜下的观察结果,确定该毒株为猪传染性胃肠炎病毒,命名为TGEV SC-1株。参照GenBank中收录的TGEV基因7的序列设计了1对特异性引物,以SC-1株的细胞增殖毒的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了大小约为303 bp的基因片段,包括完整的基因7序列片段(237 bp),在GenBank上的登录号为DQ437507。核苷酸和推导的氨基酸序列比较分析结果表明,该毒株与其他毒株的同源性均在92.4%以上,TGEV SC-1株与美国的PURDUE和中国的TH-98毒株亲缘关系最近;与日本各分离毒株、中国TS株、美国Miller株、中国台湾TFI株和英国96-1933株的同源性较低。TGEV基因7在密码子使用的选择上,存在较大的偏向性;基因7编码蛋白在两端存在有明显的疏水性区域,在2～24和56～75位氨基酸残基处存在跨膜结构。; 颜其贵欧洋郭万柱冯婷樊汶樵赖维莉曹洪志李彬; 关键词：猪传染性胃肠炎病毒病毒分离克隆

三株芽孢杆菌对大肠杆菌的体外拮抗作用研究被引量：6: 2006年; 以3株芽孢杆菌为材料,采用与致病性大肠杆菌同时接种及先后接种的方法,对其与大肠杆菌的生物拮抗作用进行了研究。结果表明:X1、X2、X33株芽孢杆菌与大肠杆菌同时接种培养后对大肠杆菌均有一定的抑菌效果,共培养8h后开始呈现一定的抑制作用,24～48h时作用最明显;先接种X1、X2、X33株芽孢杆菌培养24h后再接种大肠杆菌,对大肠杆菌均呈现明显的抑制作用,12h后开始呈现一定的抑制作用,24h时作用最明显,至48h时也还有一定的抑制作用;X3对沙门氏杆菌没有抑制作用。先接种大肠杆菌培养12h后再接种X1、X2、X33株芽孢杆菌对大肠杆菌也呈现明显的抑制作用,8h后开始呈现一定的抑制作用,12h时作用最明显,至24h时抑制作用基本消失。; 颜其贵王新郭万柱袁孟伟宋振辉李璟殷华平曹洪志; 关键词：芽孢杆菌大肠杆菌

猪细小病毒(PPV)SC1株非结构蛋白NS_1基因的克隆和序列分析被引量：8: 2005年; 本文根据GenBank中PPV NADL-2株病毒基因组序列用Oligo6.0设计了一对引物,以抽提的PPV-SC1 RF-DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.2kb的片段,将其插入克隆载体质粒pMD 18-T的EcoRV酶切位点处,构建了重组质粒pPNS1并测序.密码子偏向性分析结果表明PPV-SC1 NS1基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,主要是以A结尾的密码子;用Bioedit和swiss TMPRED软件预测PPV-SC1 NS1的跨膜区,并没有得到有显著意义的跨膜区的存在;根据基于motif数据库的结构域预测,PPV-SC1 NS1的第393～415位氨基酸残基存在潜在的ATP/GTP结合位点,该蛋白还存在16个蛋白激酶磷酸化位点,21个酪蛋白激酶2磷酸化位点,3个cAMP-/cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,PPV-SC1 NS1蛋白与POX-D5(痘病毒D5蛋白)具有一致的保守结构域,推测NS1可能与POX-D5有类似的功能.; 殷华平郭万柱徐志文罗燕; 关键词：猪细小病毒非结构蛋白 NS1基因生物信息学

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株ORF5基因在E.coli中表达的初步研究: 2007年; 根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株序列设计1对引物,应用PCR方法从重组质粒PMD-ORF5扩增得到缺失信号肽序列的基因片段dORF5,将dORF5克隆至原核表达载体PBAD/Myc-His B上,成功地构建了重组表达质粒PBAD/Myc-His B-dORF5,转化大肠埃希菌TOP10感受态细胞,经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE可检测到分子质量约为19.4 ku的目的蛋白,经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达17.1%。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,这为进一步研究GP5蛋白的结构、功能和开发新型诊断试剂盒、新型疫苗提供了理论与物质基础。; 颜其贵张传斌郭万柱欧洋肖雪曹洪志韩国全樊汶樵; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征 ORF5基因

猪细小病毒(PPV)SC1株的分离鉴定被引量：24: 2006年; 殷华平郭万柱徐志文罗燕; 关键词：猪细小病毒 PPV 母猪繁殖障碍流产胎儿新生仔猪抗体检测

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四川省应用基础研究计划项目(03JY029-035-2)