江苏省自然科学基金(BK2009417)
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 相关作者：邱文王迎伟夏梅赵聃周建博更多>>
- 相关机构：南京医科大学更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金国家自然科学基金南京医科大学科技发展基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 基因芯片筛查亚溶解型C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞基因表达差异的研究
- 2011年
- 目的:应用高通量的基因芯片技术筛查亚溶解型C5b-9(sublytic C5b-9)介导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesan-gial cells,GMCs)的基因表达谱的变化。方法:体外分离、培养大鼠GMCs,人工质控sublytic C5b-9复合物的形成,并用其刺激培养GMCs,然后分别提取sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min、3 h及未刺激对照组细胞的总RNA。经逆转录合成生物素标记的cDNA探针,然后与基因芯片杂交(涵盖31 000个转录本,代表28 000个基因)。经Affymetrix Scanner 3000扫描芯片荧光信号图像、GCOS1.4读取数据后将差异表达基因注释于GO基因功能分类体系,分析其相应的功能。结果:芯片检查数据显示,sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为4 124个和2 234个,刺激3 h时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为4 512个和2 859个;而sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min和3 h后同时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为2 325个和1 419个。sublytic C5b-9刺激GMCs表达差异基因其功能主要涉及生物学过程调节、生物调节、定位相关、刺激应答、生长发育、增殖、代谢过程、细胞生理过程、多细胞机体过程等。结论:Sublytic C5b-9刺激GMCs确能引起基因表达谱的变化。
- 周颖邱文夏梅周建博李妍赵聃王迎伟
- 关键词：肾小球系膜细胞基因芯片
- 大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定
- 2012年
- 目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatoryfactor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497～+166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用。同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1、pGL3-XAF1-2、pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)。将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功。将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加。而将pGL3-XAF1-QC、pGL3-XAF1(1～4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2。提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337～-47 nt区域。结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础。
- 周建博邱文卢燕来单锴赵聃王迎伟
- 关键词：启动子生物信息学
- 大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定被引量：4
- 2010年
- 目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功。Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达,且IRF-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料。
- 刘丽莎刘炘邱文夏梅王迎伟
- 关键词：干扰素调节因子-1小发夹RNA肾小球系膜细胞
