严沁 作品数:17 被引量:21 H指数:2 供职机构: 南京医科大学基础医学院病原生物学系 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 江苏省自然科学基金 江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目 更多>> 相关领域: 医药卫生 文化科学 更多>>
Notch1蛋白胞内段重组慢病毒载体的构建及其在原发性渗出性淋巴瘤细胞中的功能验证 被引量:1 2018年 目的:构建含Notch1胞内段(intracellular Notch1,ICN)基因的重组慢病毒载体,并检测其对Notch信号通路以及卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)潜伏感染的原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)细胞增殖能力的影响。方法:从真核表达质粒pIP-Flag-ICN中扩增出ICN基因片段,并将其插入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs Green(pHAGE)质粒中以构建重组质粒pHAGE-ICN。在人胚肾上皮细胞293T细胞中共转染重组质粒pHAGE-ICN、包装质粒psPAX2和包膜质粒p MD2.G,获得表达ICN的重组慢病毒,采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。以ICN重组慢病毒感染PEL细胞系BCP-1细胞,通过蛋白质印迹法检测ICN以及Notch信号通路下游靶蛋白的表达,采用细胞计数法检测过表达ICN对BCP-1细胞增殖能力的影响。结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pHAGE-ICN构建成功。通过慢病毒三质粒包装系统成功包装携带ICN基因的重组慢病毒,并经梯度稀释法测得病毒滴度约为2×10~7TU/mL。以ICN重组慢病毒感染BCP-1细胞,蛋白质印迹证实ICN蛋白获得有效过表达,并且能够促进Notch信号通路下游靶蛋白Hes-1的表达。细胞计数结果显示,过表达ICN能显著增强BCP-1细胞的增殖能力。结论:成功构建了含ICN基因的重组慢病毒载体,重组慢病毒介导的ICN过表达能够增强Notch信号通路活性,并增强PEL细胞的增殖能力。 赵润然 沈忱悠 严沁 卢春关键词:慢病毒 原发性渗出性淋巴瘤 IκBα显性负相重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证 被引量:1 2015年 目的:构建表达IκBα显性负相结构(dominant-negative construct,IκBα-DN)的重组慢病毒载体,并检测其对核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法:PCR扩增IκBα-DN片段并插入至p CDHCMV-MCS-EF1-cop GFP载体中。将构建的p CDH-IκBα-DN重组质粒与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,并用梯度稀释法检测病毒滴度。以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,通过免疫印迹检测IκBα蛋白的表达量。将慢病毒IκBα-DN感染已转染有NF-κB虫荧光素酶报告质粒的293 T细胞,24 h后检测IκBα-DN对NF-κB活性的影响。进一步用慢病毒IκBα-DN感染表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,v FLIP)的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),以检测IκBα-DN在NF-κB信号通路中的功能。结果:限制性内切酶鉴定以及核酸序列比对证实重组质粒p CDH-IκBα-DN构建成功。通过三质粒包装系统包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,病毒滴度约为3×107efu/m L。以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,免疫印迹结果表明胞质中IκBα蛋白的表达量明显升高。虫荧光素酶报告实验结果提示,重组慢病毒介导的IκBα-DN能有效抑制NF-κB的活性。在表达KSHV v FLIP的HUVECs中,IκBα-DN也能显著减弱NF-κB通路信号。结论:成功构建的含IκBα-DN序列的慢病毒能够有效地感染293 T细胞和内皮细胞,且初步结果提示IκBα-DN能增加胞质内IκBα的含量,并进一步抑制NF-κB信号的传递。 路尧 严沁 卢春关键词:核转录因子-ΚB IΚBΑ 慢病毒 抗击新冠疫情 共守健康安全 2020年 刚刚结束的庚子鼠年春节对每个人而言都是一个特殊的节日。在这个对中国人具有重要意义的传统佳节里,一场突如其来的新型冠状病毒肺炎疫情阻拦了人们团圆的脚步,一群看不清面孔的"最美逆行者"用汗水和生命守护着人民的健康。那么,作为这场疫情阻击战中的一员,您一定想知道这场疫情是如何发生的?它的元凶究竟是谁?怎样做好防护工作呢? 沈洪兵 季旻珺 严沁 贾佳 王建明 喻荣彬关键词:新型冠状病毒 冠状病毒感染 一种长链非编码RNA lncRNA-CRNN及其应用 本发明提供一种长链非编码RNA?lncRNA-CRNN及其应用。根据lncRNA-CRNN在宫颈癌组织中呈现低水平表达,构建过表达lncRNA-CRNN的SiHa细胞系,研究lncRNA-CRNN在宫颈癌细胞肿瘤形成中的... 严沁 卢春文献传递 KSHV vFLIP在血管内皮细胞中的表达及其功能验证 被引量:1 2014年 目的:构建含卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,vFLIP)基因的重组慢病毒表达载体,获得稳定表达vFLIP的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并检测vFLIP在HUVECs中活化NF-κB信号通路的能力。方法:以真核表达质粒pEF-vFLIP为模板扩增vFLIP基因,插入至慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green中构建重组质粒pHAGE-vFLIP。利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293 T细胞,收集过滤后的培养上清获得慢病毒悬液。利用梯度稀释法测定病毒滴度后,以一定感染复数的慢病毒感染HUVECs,通过蛋白质印迹法检测vFLIP的表达。经绿色荧光蛋白(GFP)流式分选以及蛋白质印迹法验证获得稳定表达vFLIP的HUVECs。最后,通过虫荧光素酶报告实验检测NF-κB的活性,免疫荧光染色检测NF-κB亚基p65的细胞定位,蛋白质印迹法检测IκBα蛋白的表达来评价稳定表达vFLIP蛋白的HUVECs功能。结果:核酸序列测定证实含vFLIP基因的慢病毒表达载体已构建成功。重组慢病毒感染HUVECs后可检测到vFLIP的表达。通过流式分选获得了稳定表达vFLIP的HUVECs细胞,并且能通过抑制IκBα的降解,阻碍p65入核来活化NF-κB,从而激活经典NF-κB信号通路。结论:成功包装了含KSHV vFLIP基因的重组慢病毒,并获得具有激活NF-κB信号通路功能、稳定表达vFLIP的HUVECs株。 金镠洋 严沁 卢春关键词:慢病毒 卡波氏肉瘤 人脐静脉内皮细胞 核因子-ΚB SH3域结合谷氨酸富含蛋白在宫颈癌组织中的表达及其临床意义的分析 2021年 目的分析SH3域结合谷氨酸富含蛋白(SH3BGR)基因在宫颈癌组织中的表达及其临床意义,研究SH3BGR蛋白对宫颈癌细胞系He La恶性转化、增殖和迁移能力的影响,并初步探索其调控机制。方法采用免疫组织化学染色方法(IHC)检测SH3BGR蛋白在宫颈癌组织中的表达。运用TCGA数据库和生物信息学相关方法分析SH3BGR表达水平与宫颈癌临床分期和患者生存率的关系。采用PCR进行SH3BGR基因的扩增,将其克隆至p HAGE-CMV-MCS-Izs Green载体,构建重组慢病毒表达质粒p HAGE-SH3BGR。将重组质粒p HAGESH3BGR与包膜质粒pMD2. G和包装质粒psPAX2共转染入人胚肾上皮细胞HEK293T,包装重组慢病毒,运用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒SH3BGR感染人宫颈癌细胞系He La,通过Western blot验证SH3BGR蛋白的表达。采用细胞增殖实验(CCK-8)、细胞划痕实验和软琼脂克隆形成实验分别评价过表达SH3BGR对HeLa细胞增殖、迁移及恶性转化能力的影响。运用小干扰RNA(siRNA)敲低人乳头瘤病毒(HPV) E6/E7基因,观察SH3BGR蛋白的表达。结果 SH3BGR蛋白在宫颈癌组织中表达明显高于癌旁组织,SH3BGR高表达宫颈癌患者生存期显著短于低表达患者。慢病毒载体介导的SH3BGR蛋白的过表达可显著提高He La细胞的增殖、迁移和恶性转化能力。敲低HPV E6/E7可以抑制SH3BGR蛋白的水平。结论 HPV可能通过E6/E7上调SH3BGR蛋白的表达,促进宫颈癌恶性转化、增殖、迁移,SH3BGR蛋白的高表达不利于宫颈癌患者的生存。 钱晓涵 盛柳雪 李婉 严沁 卢春关键词:人乳头瘤病毒 宫颈癌 MicroRNAs和信号通路在HIV-1 Nef蛋白调控KSHV潜伏感染中的作用 背景:卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)与一些获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)... 严沁关键词:KSHV MICRORNAS RTA 文献传递 人类免疫缺陷病毒-1负调控因子通过调控糖原合成酶激酶-3β/β连环蛋白信号通路促进人类疱疹病毒8型病毒白细胞介素6诱导血管生成 2014年 目的 探讨糖原合成酶激酶(GSK)3β/β连环蛋白信号通路在HIV 1负调控因子(Nef)蛋白促进人类疱疹病毒8型(HHV-8)病毒白细胞介素6(vIL-6)诱导血管生成中的作用.方法 将GSK-3β突变质粒GSK-3β-S9A、显性负相质粒GSK 3β-DN及其对照质粒pcDNA3.1+分别转染稳定表达HHV-8 vIL-6、HIV-1-Nef以及共表达vIL-6和Nef蛋白的内皮细胞,观察EA.hy 926细胞微管形成;将上述转染质粒的细胞接种鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)检测血管生成情况;Western印迹法检测转染上述质粒的细胞及CAM组织中GSK-3β/β连环蛋白通路中信号分子的表达水平.计量资料两两比较采用t检验.结果 转染GSK-3β-DN降低GSK-3β活性,能增强HIV-1 Nef蛋白促进vIL-6诱导微管形成(3.42比2.51,t=3.67,P<0.01)和血管生成(6.25比3.97,t=4.06,P<0.01)的能力.转染GSK-3β-S9A活化GSK-3β,则能显著抑制Nef蛋白的上述功能(0.62比2.51,t=8.48,P<0.01;0.39比3.97,t=8.59,P<0.01).转染GSK-3β-DN后,细胞或组织中信号通路下游β连环蛋白(细胞中:3.53比2.07,t=6.60,P<0.05;组织中:2.76比1.74,t=17.40,P<0.01)、血管内皮生长因子(VEGF,细胞中:2.68比1.87,t=4.28,P<0.01;组织中:2.20比1.39,t=7.08,P<0.01)的表达升高;转染GSK-3β-S9A后,GSK-3β的磷酸化水平降低(细胞中:0.50比1.47,t=7.33,P<0.01;组织中:0.35比1.97,t=10.72,P<0.01),β连环蛋白(细胞中:1.05比2.62,t=29.50,P<0.01;组织中:0.79比1.77,t=5.72,P<0.01)、VEGF(细胞中:0.74比2.16,t=20.95,P<0.01;组织中:0.43比1.65,t=11.89,P<0.01)的表达也随之减少.结论 GSK-3β/β连环蛋白信号通路参与调控HIV-1 Nef蛋白促进HHV-8 vIL-6诱导血管生成,极可能成为临床治疗艾滋病患者卡波齐肉瘤的一个潜在分子靶点. 姚水洪 邱惠萍 刘建军 朱小飞 秦娣 严沁 卢春关键词:人免疫缺陷病毒1型 负调控因子 糖原合成酶激酶3 白细胞介素6 MOOC时代的《医学微生物学》课程改革初探 被引量:15 2015年 2012年被称为"MOOC(大规模开放式网络课程,Massive Open Online Course)元年",中国高等医学院校也积极参与到MOOC的浪潮中。鉴于MOOC给传统高等教育模式带来的巨大机遇和挑战,结合微生物学在新时期独特的发展特点,本文探讨了如何将MOOC模式应用于《医学微生物学》课程,以期提高课程的教学质量,推进课程改革进程。 严沁关键词:课程改革 深度学习视角下的病原生物学PRIDE教学创新策略 2022年 病原生物学是临床医学和预防医学专业的基础课程,主要教授与医学相关的病原微生物学知识。为适应全球感染性疾病谱和医学教育模式的改变,培养具有核心胜任力的卓越医生,课程围绕以学生为中心的教学理念,在教学过程中对标深度学习理论,创建PRIDE教学策略,形成培养深度学习能力的课程教学环境,全面提高医学生的高阶思维。 邱竞帆 季旻珺 严沁 严沁 周莎 于鑫焱 贾佳关键词:病原生物学 教学改革