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双剪接型2．2 kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白的反式激活作用被引量：5: 2006年; 目的研究双剪接型2．2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体编码的新蛋白的功能。方法PCR扩增双剪接型2．2kb HBV剪接特异性新基因并克隆于哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1/ HisC。以FuGENE6将此重组载体(pcDNA3．1/HisC-TPds)转染Huh7细胞,采用融合表达的多肽表位(X- press表位)抗体,通过Western blot检测目的蛋白在不同时间段的表达。pcDNA3．1/HisC-TPds分别与β-半乳糖苷酶报告载体psv-β-galactosidase(含SV40启动子/增强子)或pCMVβ(含CMV即刻早期启动子)共转染Huh7细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内β-半乳糖苷酶活性,实验数据以SPSS11．5软件分析。结果克隆420bp双剪接型2．2kb HBV剪接变异体新基因,Western blot显示其在Huh7细胞中表达相应蛋白,以转染后48h为最高。在含有CMV即刻早期启动子或SV40启动子/增强子的报告载体与pcDNA3．1/HisC-TPds质量比为1：10～1：50范围内,共转染有报告载体及pcDNA3．1/HisC-TPds的Huh7细胞内β-半乳糖苷酶活性均大于相应的pcDNA3．1/HisC空白载体对照组,且在1：10～1：40范围内存在剂量-效应关系。结论双剪接型2．2kb HBV剪接变异体编码的新蛋白可反式激活CMV即刻早期启动子及SV40启动子/增强子,提示其可能与HBV致病有关。; 陈婉南黄清玲林建银王林郭丹华林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接反式激活

含MPN结构域蛋白(MPND)通过上调乙型肝炎病毒X蛋白水平影响其功能: 2022年; 乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)在生成后即被快速降解,但目前影响HBx稳定性的机制仍未完全阐明。课题组前期通过酵母双杂交筛选与HBx具有相互作用的去泛素化酶(Deubiqutinases,DUBs),含MPN结构域蛋白(MPN domain containing protein,MPND)为筛选获得的蛋白之一。本研究首先采用免疫共沉淀和激光共聚焦实验验证HBx与MPND的相互作用,并通过酵母双杂交实验进一步分析两者相互作用的区域。Western blot检测过表达MPND的肝癌细胞中HBx蛋白水平的变化。以蛋白合成抑制剂环己酮亚胺(Cycloheximide,CHX)或蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测MPND对HBx蛋白半衰期及降解途径的影响。通过泛素化实验分析MPND对HBx泛素化水平的影响。采用双荧光素酶报告基因检测实验和克隆形成实验检测MPND对HBx生物学功能的影响。结果显示,MPND与HBx在肝癌细胞内存在相互作用,且HBx的26~50和81~120位氨基酸与MPND的272~362位氨基酸介导HBx与MPND的结合;过表达MPND的肝癌细胞中,HBx蛋白水平显著增高,HBx的半衰期明显延长,且蛋白酶体抑制剂处理后,MPND对HBx蛋白降解的抑制效果更为显著,但HBx泛素化水平没有变化;共表达MPND与HBx的肝癌细胞中,MPND通过上调HBx蛋白水平,进而促进了HBx对NF-κB启动子的反式激活作用,且进一步抑制克隆形成。本研究表明,MPND通过泛素非依赖-蛋白酶体途径抑制HBx降解,从而增加HBx蛋白水平,调控HBx功能,可能参与HBV致病机制,以此蛋白相互作用为靶标,将为HBV感染相关肝脏疾病的治疗提供有益思路。; 张翼吴琼施佳健张璐林旭林旭; 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白蛋白酶体蛋白降解

肝细胞癌患者B和C基因型乙型肝炎病毒X蛋白的变异特点被引量：8: 2004年; 背景与目的X蛋白是乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)最重要的致病因子之一,它在HBV相关性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生发展中起着重要作用。目前已知B、C基因型HBV相关性HCC的临床及病理表现不尽相同,但目前尚不清楚这种差别是否与B、C基因型HBVX基因之间的差别有关。因此本实验拟研究B、C基因型间HBVX蛋白氨基酸差异及其在HCC患者中的变异及特点,初步探讨其与HCC发生、发展的关系。方法PCR扩增22份乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性HCC患者血清HBVX基因,克隆、测序并以VectorNTI6.0软件分析其基因型。以DNAMAN软件对标准HBV及HCC来源的HBVX蛋白进行氨基酸同源分析。结果检测的22个HBVX基因片段均属于B或C基因型。B、C基因型HBVX蛋白之间存在14个氨基酸的差异,HCC患者来源的B、C型HBVX蛋白存在4个氨基酸的共有变异,C型HBVX蛋白尚有6个型特异性变异。这些差异或变异氨基酸均位于X蛋白B、T细胞表位或反式激活区及调节区内。结论B、C基因型HBVX蛋白之间存在氨基酸差异,且在HCC中发生基因型特异性变异,这些差异或变异氨基酸可能导致X蛋白免疫学功能及反式激活功能的不同。; 徐晓陈婉南郑大利黄清玲林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 X基因基因型肝细胞癌

乙型肝炎病毒核心蛋白通过调控mFas及sFas表达抑制Fas介导的肝细胞凋亡: <正>目的探讨乙型肝炎病毒核心蛋白对Fas介导的肝细胞凋亡的影响及其机制。方法 pcDNA3.1/hygro(+)克隆HBc基因,分别转染人肝癌细胞株HepG2,Huh7及Hep3B,潮霉素筛选获得HBc表达细胞株。激动...; 刘伟闫小利陈婉南林旭; 文献传递

小分子乙型肝炎病毒基因组缺失突变体结构分析被引量：1: 2008年; 目的了解小分子HBV基因组缺失突变体的基因结构及特点。方法采用一步法PCR从慢性乙型肝炎患者血清中扩增全基因组HBVDNA，回收并克隆〈1kb的小分子HBVDNA，测序并以BioEdit及VectorNTI6．0软件分析基因结构特点。结果获得基因长度介于174～986bp之间的64种、共124个小分子HBV缺失突变体DNA，按基因结构特点分为3类，即3种GT-AG剪接变异体、29种“常规”缺失突变体及32种基因组内部含polyA的缺失突变体。所有小分子基因组缺失突变体在HBV各编码区及基因调控区均存在不同程度缺失，其中66％（42／64种）保留与HBV复制（包装）相关的所有顺式调控序列，48％（31／64种）保留X编码区。结论乙型肝炎患者血清中普遍存在小分子HBV基因组缺失突变体，深入了解这些变异体的结构和功能，有助于进一步探索HBV的致病机制。; 郭丹华王林黄清玲林万松陈婉南林旭; 关键词：肝炎病毒乙型基因缺失聚合酶链反应

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响被引量：2: 2008年; 目的研究双剪接型2，2kb乙型肝炎病毒（HBV）剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响。方法PCR扩增6种HBV启动子／增强子序列，以Kpn I及Xho I位点克隆于pGL3-basic，分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP（含HBV基本核心启动子）、pGL3-CP1601（含增强子Ⅱ的核心启动子）、pGL3-XP（X基因最小启动子）、pGL3-XP1071（含增强子I的X基因启动子）、pGL3-SP1（表面抗原大蛋白基因启动子）、pGL3-SP2（表面抗原中蛋白基因启动子）。以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1／HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1／HisC分别与6种HBV启动子／增强子报告载体共转染Huh7细胞，转染后48h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性，实验重复5次，数据以SPSS11.5软件分析。结果在一定的质量比值范围内，与pcDNA3.1／HisC空白载体对照相比，pcDNA3.1／HisC-TPds分别与pGL3，CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后，Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高，而pcDNA3.1／HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后，胞内荧光素酶活性无变化。结论TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子I、Ⅱ，对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响。; 陈婉南陈金烟王林林万松林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接反式激活增强子

乙型肝炎病毒458nt-1308nt剪接特异性蛋白抗α-干扰素作用被引量：2: 2008年; 目的研究乙型肝炎病毒（HBV）458nt-1308nt剪接特异性蛋白TSR′r′（源于HBVDNA聚合酶读码框，T代表TP区，S为Spacer区，R′为截短的RT区，r′为截短的RNaseH区）抗α-干扰素（IFN-α）作用并分析其功能区域。方法PCR扩增获得HBV458nt-1308t剪接变异体剪接特异性基因TSR′r′及其缺失突变体，并克隆于pcDNA3.1／HisC。重组载体以FuGENE6转染Huh7肝细胞，通过融合表达的多肽表位抗体，Western blot检测目的蛋白表达。TSR′r′及其缺失突变体重组载体分别与IFN-α反应报告载体p6-16CAT共转染Huh7肝细胞，转染后48h给予终浓度为100IU／ml的IFN-α2a刺激，作用24h后裂解细胞，检测胞内氯霉素乙酰基转移酶（CAT）含量。所有实验数据采用单因素方差分析法进行统计分析。结果构建TSR′r′及其缺失突变体重组真核表达载体，Western blot显示各基因片段在Huh7细胞中均表达相应蛋白。06-16CAT共转染结果显示，随着TSR′r′重组表达载体转染量的递增，Huh7胞内CAT值逐渐降低。此外，转染TP＋Spacer区的缺失突变体可导致Huh7胞内CAT值显著下降，而其他各类TSR′r′缺失突变体共转染后胞内CAT值无变化。结论HBV458nt-1308nt剪接特异性蛋白抑制Huh7细胞对IFN-α的反应性，其活性与N端的TP及Spacer区有关。; 王林黄清玲郭丹华陈婉南林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接 Α-干扰素 DNA聚合酶

酵母双杂交筛选与单剪接型2．2kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白: 2010年; 目的筛选与单剪接型2．2kb乙型肝炎病毒（HBV）剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白。方法PCR扩增单剪接型2．2kbHBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7，在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下，以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白，进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss，Westernblot显示其在酵母中表达TPss蛋白。酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用，即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链。结论TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用。; 陈婉南陈金烟黄清玲林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接酵母双杂交

2.2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体特异性新蛋白的功能研究: HBV基因组剪接变异体是由HBV前基因组RNA(pgRNA)经剪接并逆转录产生的亚基因组DNA。长度为2.2Kb的HBV剪接变异体占80％以上，分为双剪接型和单剪接型，它们可编码剪接特异性新蛋白并与病毒的持续性感染及致病...; 陈婉南; 关键词：乙型肝炎病毒反式激活启动子酵母双杂交

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白HBSP与TGFβ1诱导蛋白1相互作用促进TGFβ1诱导的肝癌细胞上皮间质转化被引量：5: 2017年; 目的探讨乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白(Hepatitis B spliced protein,HBSP)与转化生长因子1诱导蛋白1(transforming growth factor-β1-induced transcript 1,TGFβ1I1)相互作用对TGFβ1诱导的肝癌细胞上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的影响。方法构建HBSP慢病毒表达载体,利用293T细胞包装慢病毒颗粒,感染Huh7肝癌细胞株。以5ng/mLTGFβ1分别诱导稳定表达HBSP的慢病毒细胞株及其对照细胞株,观察细胞形态的变化,并提取细胞蛋白,Westernblot检测上皮间质转化标志物E-钙黏素(E-cadherin,E-cad)、紧密连接蛋白(Claudin-1)、β-链蛋白(β-catenin)、N-钙黏素(N-cadherin,N-cad)的变化。进而以TGFβ1I1特异性siRNA转染上述细胞,Westernblot观察以上指标变化情况。最后以侵袭小室实验和划痕实验分别检测TGFβ1诱导的细胞侵袭与迁移能力的变化。结果筛选获得稳定表达HBSP的慢病毒细胞株Huh7-HBSP-flag-HIV及其对照细胞株Huh7-flag-HIV。以TGFβ1诱导后在显微镜下观察到细胞形态由紧密的上皮形态变为松散的间质形态;特异性抗体检测表明上皮标志物E-cad、Claudin-1、β-catenin表达量下降,而间质标志物N-cad表达上升。侵袭小室实验和划痕实验表明TGFβ1诱导的HBSP表达株侵袭及迁移能力增强。而转染TGFβ1I1特异性siRNA可逆转以上现象。结论 HBSP与TGFβ1I1相互作用可促进TGFβ1诱导的肝癌细胞上皮间质转化并增强其侵袭迁移能力,提示HBSP在HBV相关性肝细胞肝癌发生发展中具有重要的致病意义。; 陈婉南黄俊高梁菲菲闫小利轩丹丹林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接上皮间质转化

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陈婉南

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