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高体积分数氧致A549细胞肺表面活性物质蛋白-A表达的变化被引量：4: 2012年; 目的探索高体积分数氧(高氧)致A549细胞肺表面活性物质蛋白(SP)-A表达的变化规律。方法将A549细胞分为高氧组和常氧组。高氧组细胞置于含950 mL·L-1氧气和50 mL·L-1二氧化碳的条件下培养,常氧组以空气替代氧气,于0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h在倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,提取细胞内总蛋白,采用硫代巴比妥酸比色法检测其丙二醛(MDA)水平,Western blot检测其SP-A表达水平。结果高氧48 h可导致A549细胞生长明显减慢,72 h后细胞生长停滞,可见较多漂浮死亡细胞,96 h后漂浮死亡细胞明显增多。高氧组各时间点A549细胞SP-A表达水平均高于常氧组,高氧24 h SP-A表达增多最显著,此后增多的幅度逐渐减小,高氧48 h后细胞内MDA水平显著高于常氧组,随时间延长,MDA水平进一步升高。结论高氧可导致A549细胞损伤,SP-A表达在细胞高氧损伤早期代偿性增加,晚期降低,推测SP-A表达降低可能与细胞损伤加重有关,增加SP-A的表达可能有助于减轻高氧引起的细胞损伤。; 徐洪涛杨慧常立文李文斌赵玲霞袁文浩刘伟蔡保欢王席娟; 关键词：高体积分数氧 A549细胞

高体积分数氧对小分子干扰RNA介导肺表面活性蛋白A基因沉默后A549细胞的影响: 2013年; 目的探索小分子干扰RNA（SiRNA）沉默A549细胞肺表面活性蛋白A（SP-A）基因后高体积分数氧（高氧）对其的影响，探讨SP-A蛋白在高氧肺损伤中的作用。方法体外传代培养A549细胞，将细胞随机分为沉默组、对照组。以Lipofectamine2000转染特异性SiRNASP-A转入A549细胞，持续置于高氧（950mlVLO2和50mL／LCO2）中，分别于培养48h、72h、96h提取A549细胞的总蛋白，收集培养上清。采用Western-blot检测SP-A蛋白的表达，噻唑兰（MTF）检测细胞增殖能力，硫代巴比妥酸（TAB）比色法检测培养基上清中丙二醛（MDA）水平。结果序列特异性SiRNA可显著沉默SP-A基因表达，其中SiRNASP-A2的沉默效率最高（97％）。高氧干预下，与对照组相比，沉默组A549细胞SP-A蛋白表达在高氧48h、72h时均显著减少（P均〈0．05），沉默组A549细胞增殖能力在高氧48h、72h、96h均受到明显抑制（P均〈0．05）。但2组问培养基中MDA水平未见明显差异（P〉0．05）。结论SP-A基因沉默后A549细胞抗高氧能力下降，表明SP-A可能在高氧肺损伤过程起保护作用。; 杨慧徐洪涛常立文李文斌; 关键词：小分子干扰RNA 肺表面活性蛋白A A549细胞

SP-B中间产物特异性抗体的制备与鉴定: 2013年; 目的制备和鉴定表面活性物质蛋白B(surfactant protein B,SP-B)加工处理过程中部分中间产物的特异性抗体。方法利用Lasergene 7.0和Macvector 11.0.4软件进行抗原表位分析,确定作为抗原的3条多肽序列,将人工合成的多肽与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,免疫兔制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫前血清背景和免疫后血清效价,抗原亲和纯化抗血清,超滤浓缩抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹(Western blot)鉴定抗体特异性。结果免疫前兔血清背景均低,免疫后抗血清效价均达到要求,抗原亲和纯化后所得抗体纯度及效价高,特异性好。结论成功制备了3种SP-B中间产物特异性多克隆抗体,为深入研究SP-B的加工处理奠定了基础。; 徐洪涛杨慧常立文李文斌赵玲霞袁文浩刘伟蔡保欢王席娟; 关键词：多克隆抗体

真核表达载体pIRES2-EGFP-SP-B-C／T1580的构建及其在293T细胞中的表达被引量：1: 2012年; 目的构建两种人肺表面活性物质蛋白B（surfactant protein B，SP．B）基因变异型的真核表达载体，研究SP-B基因多态性与支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）的关系。方法应用基因重组技术，构建pIRES2-EGFP-SP-B-C1580和plRES2-EGFP-SP-B．T1580真核表达质粒，经测序鉴定后，采用脂质体法转染293T细胞系，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在293T细胞中的表达，逆转录一聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（reverse transcription-polymerase chain reaction-re-striction fragment length polymorphism,RT-PCR-RFLP）检测SP-B-C/T1580mRNA的表达，Westernblot检测SP-B蛋白的表达。结果两个重组质粒含有完整sP-BcDNA，在1580位点碱基序列分别为C和T，转染293T细胞后有相应的mRNA及蛋白表达。结论成功构建了真核表达载体plRES2．EG。FP-SP-B-C／T1580，为揭示支气管肺发育不良的发生机制奠定基础。; 徐洪涛杨慧常立文李文斌赵玲霞袁文浩刘伟蔡保欢王席娟; 关键词：支气管肺发育不良遗传学遗传学

Lipofectamine 2000和jetPRIME^(TM)对A549细胞转染效率及毒性的比较研究: 2012年; 目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例(μg/μl)在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例(μg/μl)为1∶2.5时转染率最高,达(50.6±4.9)%,细胞存活率为(89.2±9.1)%;质粒与jetPRIMETM比例(μg/μl)在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例(μg/μl)为1∶2时转染率最高,为(30.6±2.8)%,细胞存活率为(100.6±4.8)%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异(P<0.01,P<0.05)。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。; 徐洪涛杨慧常立文李文斌赵玲霞袁文浩刘伟蔡保欢王席娟; 关键词：A549细胞转染细胞毒性

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杨慧