邹小辉
- 作品数：32 被引量：25H指数：3
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学自动化与计算机技术生物学更多>>
- 一种人41型腺病毒(Ad41)包装细胞株及其应用
- 本发明涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种人41型腺病毒(Ad41)的包装细胞株及其应用，具体地说，本发明涉及一种人41型腺病毒(Ad41)包装细胞株293TE7及其应用，该包装细胞株稳定表达Ad41 E1B55K基因，可以...
- 鲁茁壮洪涛王敏邹小辉
- 文献传递
- 人细小病毒B19病毒样颗粒的制备被引量：3
- 2009年
- 采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒(VLPs)。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。
- 邹小辉董流昕宋敬东屈建国于修平鲁茁壮洪涛
- 关键词：细小病毒B19VP2杆状病毒病毒样颗粒
- 纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染被引量：2
- 2021年
- 基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV⁃5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV⁃11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强。本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包膜糖蛋白(gp120)的V3结构域,观察重组HAdV⁃5对造血细胞感染效率的变化。在前期构建的pKAd5f11p153R⁃EPG腺病毒质粒基础上,结合限制性酶切和DNA组装技术,在F11p 153 aa后(knob AB loop,153位)、228位(FG loop)以及300位(IJ loop)插入RGD4C肽或者gp120的V3肽,构建了共6种重组腺病毒载体(F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG、F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG、F228CV⁃EG和F300CV⁃EG),以fiber未改造的HAdV5⁃EG和改造为F11p的F11p⁃EG病毒作对照,观察了其对4种造血细胞系U937、K562、Jurkat和HL60以及人原代T细胞的感染效率。结果显示,对于U937细胞,当感染复数(MOI,vp/cell)为100时,HAdV5⁃EG感染效率最低,为2%;其次为F228CV⁃EG,感染率为45%;F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG和F300CV⁃EG感染率为85%~90%;F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG高于阳性对照病毒F11p⁃EG,三者分别为99%、99%、95%。各病毒对于Jurkat细胞的感染率均较高,但HAdV5⁃EG明显低于F11p⁃EG、F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG,当MOI为100时分别为75%、93%、93%和96%。感染K562细胞的情况与U937细胞类似。各病毒对于HL60细胞感染效率最低,MOI为500时,F300RGD⁃EG和F300CV⁃EG的转导效率为28%和33%,是F11p⁃EG的10倍。对于人原代T细胞,F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG优于F11p⁃EG,当MOI为1000时,感染率分别为87%、90%和84%。研究结果表明,F11p knob插入RGD4C比单独F11p替换的HAdV⁃5对造血细胞的感染效率高,同时,本研究还发现HAdV⁃11p fiber knob的AB、FG或IJ loop可插入外源多肽,为腺病毒嗜向性改造增加了新靶点。
- 郭小娟梅玲玲付鸿臣邹小辉鲁茁壮洪涛
- 关键词：造血细胞
- 复制型重组人41型腺病毒载体系统及其应用
- 提供一种复制型人41型腺病毒(HAdV‑41)载体系统及重组病毒构建方法。载体系统包括腺病毒质粒pKAd41P5A‑CG。该质粒含有人工改造的HAdV‑41基因组：E1区和E4区启动子由HAdV‑5对应序列替换；E3区由...
- 鲁茁壮邹小辉郭小娟
- 文献传递
- 一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用
- 本发明公开了一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用。本发明的禽4型腺病毒载体包括pBR322质粒的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性基因核酸序列和禽4型腺病毒的基因组序列；所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1...
- 邹小辉鲁茁壮刘兴龙章振华赵蕾
- 利用293细胞拯救和扩增重组人41型腺病毒
- 2015年
- 人41型腺病毒(Human adenovirus type 41,HAdV-41)为难养腺病毒,E1区缺失的HAdV-41无法在293细胞中拯救并扩增,本研究试图通过反向遗传学操作获得能够在293细胞中拯救并扩增的重组HAdV-41。首先,对原有的骨架质粒pAdbone41进行改造:通过重叠延伸PCR方法将HAdV-41的E3区基因替换为HAdV-5E4orf6编码区;将HAdV-5E1A增强子克隆至HAdV-41E4区启动子上游,获得新的骨架质粒pAdbone41E4EE。该骨架质粒与线性化的穿梭质粒pSh41-GFP在E.coli BJ5183菌株同源重组得到腺病毒质粒pAd41E4EE-GFP。pAd41E4EE-GFP经Pme I酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组病毒HAdV-41-E4EE-GFP。经过7轮扩增,超速离心纯化后获得1.0ml浓度为8.0×10^(10) vp/mL的重组腺病毒,其感染滴度为1.7×10~9 IU/mL,电子显微镜下观察可见形态完整的病毒颗粒,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定结果均表明携带HAdV-5E4orf6基因与E1A增强子基因的重组腺病毒载体构建正确。本研究利用反向遗传学技术对病毒载体进行改造,实现了在293细胞中培养E1区缺失的HAdV-41的目的。
- 邹小辉郭小娟肖蓉王敏鲁茁壮洪涛
- 关键词：病毒载体
- 光镜-电镜偶联的蛋白标记技术的初步建立
- 邹小辉屈建国鲁茁壮洪涛
- Ⅲa基因缺失的人7型腺病毒载体系统的建立
- 2024年
- 为了获得既能高效扩增外源基因,又不产生复制型子代病毒的腺病毒载体,我们构建了一个Ⅲa基因缺失的单周期腺病毒载体。本研究在前期已构建的E3区携带绿色荧光蛋白GFP的人7型腺病毒载体pK-Ad7E3GFP基础上进行。首先设计引物扩增包含氨苄青霉素抗性基因和质粒复制起点的AMP-ORI片段,利用限制性内切酶Asc I将pK-Ad7E3GFP切割为29.1kb与7.7kb的大小片段,其中,7.7kb小片段与AMP-ORI片段组装,获得第一个中间质粒pA-Ad7E3GAscI;经重叠延伸PCR、酶切、DNA组装等方法,将pA-Ad7E3GAscI上的Ⅲa基因进行删除,获得第二个中间质粒pA-AscDⅢa;经Pme I酶切的pA-AscDⅢa与上述29.1kb大片段经DNA组装后,得到重组腺病毒质粒pK-Ad7DⅢaE3GFP。同时,构建携带Ⅲa基因的真核表达载体pTPL-Ⅲa,转染293细胞,经G418筛选构建细胞系293-Ⅲa。结果发现,经Pme I线性化的pK-Ad7DⅢaE3GFP质粒转染293-Ⅲa细胞,7d后可见荧光聚集,且逐渐增大,表明重组腺病毒Ad7DⅢaE3GFP拯救成功;提取病毒基因组进行PCR鉴定,结果与预期相符;细胞培养上清经负染后,在电镜下可见腺病毒典型的正二十面体形态,培养细胞中也可见病毒呈晶格排列;以上结果均表明Ad7DⅢaE3GFP拯救成功。本研究成功建立了Ⅲa基因缺失的单周期人7型腺病毒载体系统,为该载体的研究与应用奠定基础。
- 王洋王永进侯文哲郭小娟郑贵森邹小辉
- 关键词：病毒拯救
- 人巨细胞病毒感染指示细胞株的建立
- 2015年
- 目的 建立指示细胞株,该细胞株被人巨细胞病毒（HCMV）感染后能够诱导表达绿色荧光蛋白（GFP）.方法 使用PCR方法克隆GFP基因和HCMV UL54基因的启动子（UL54p）;用GFP替换质粒pGL4.17[luc2/Neo]中的luc2基因,并将UL54p序列插入多克隆位点得到报告质粒pGL4UL54p-GFP.将该质粒转染永生化的人胚肺成纤维细胞MRC-5T,通过G418筛选,获得多株克隆化的MRC-5TUG细胞.使用HCMV（AD169毒株）感染各株MRC-5TUG,利用荧光显微镜观察GFP表达情况.使用人5型腺病毒和H1N1甲型流感病毒感染筛得的目的细胞株,观察GFP表达情况.结果 构建的报告质粒pGL4UL54p-GFP经酶切和测序鉴定,证实与预计的一致.质粒转染MRC-5T细胞,筛得9株MRC-5TUG克隆化细胞株;HCMV感染后,有2株细胞GFP表达由阴转阳,其中MRC-5TUG#7细胞GFP表达最强.人腺病毒和流感 病毒感染MRC-5TUG#7,GFP不表达.结论 成功构建了MRC-5TUG细胞,该细胞可以用于指示HCMV的感染。
- 郭小娟邹小辉吴萌屈建国鲁茁壮洪涛
- 关键词：巨细胞病毒基因表达荧光抗体技术
- 适配器-超速离心法提高电镜检测病毒的灵敏度被引量：1
- 2010年
- 通过专用超速离心机将病毒直接离心至载网是重要的提高诊断电镜灵敏度的方法,作者尝试建立适配器-超速离心法实现相同目的。设计制造了外形类似离心管的载网适配器,其内部有一平底的凹槽,可以放置电镜载网,添加病毒悬液后,经过超速离心,能够将病毒粒子直接离心到载网上。利用重组腺病毒和重组腺相关病毒为模式病毒,适配器-超速离心法较悬滴法的病毒检测灵敏度提高了50～200倍;对人腺病毒41型(Ad41)细胞培养物进行电镜检测,灵敏度提高了50倍。如果将免疫凝集法(immune clumping)与适配器-超速离心法相联合进行电镜制样,检测灵敏度较常规免疫凝集法提高1～2个数量级。这些结果说明适配器-超速离心法能够高效地富集病毒,可以应用于病毒的电镜检测工作。
- 屈建国余兴明鲁茁壮邹小辉宋敬东洪涛
- 关键词：适配器超速离心
