刘桂明
- 作品数：21 被引量：11H指数：2
- 供职机构：中国科学院微生物研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程医药卫生化学工程更多>>
- 地中海富盐菌中丙酰-CoA/乙酰-CoA羧化酶的鉴定及其缺失对全局代谢的影响
- 侯靖刘桂明向华韩静
- 用于生产冰核蛋白的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
- 本发明提供一种用于生产冰核蛋白的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。所述重组大肠杆菌是利用基因工程手段将冰核蛋白基因或冰核蛋白基因表达盒整合到大肠杆菌的染色体上构建得到的。本发明通过将冰核蛋白基因整合到大肠杆菌的染色体中，并...
- 刘桂明张子娟赖小勤晏礼明
- 一种来源于谷氨酸棒杆菌的启动子及其应用
- 本发明公开了一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)：1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且...
- 丁久元刘桂明李开赵智王宇张英姿
- 文献传递
- 罗氏真养菌W50的D-木糖代谢途径工程改造被引量：2
- 2014年
- 【目的】拓宽高产聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)W50的碳源使用范围,使其获得D-木糖代谢能力。【方法】运用PCR技术扩增大肠杆菌(Escherichia coli)K-12W3110来源的D-木糖转运蛋白基因xylE,利用同源重组技术将xylE基因整合到R.eutropha W50的染色体上构建菌株W50-E。运用PCR技术扩增E.coli K-12 W3110来源的D-木糖代谢基因xylAB和R.eutropha H16来源的PHA合酶基因phaC1的启动子片段P pha C1,同表达载体连接后构建重组质粒p1-AB。将重组质粒分别转入菌株R.eutropha W50和W50-E中构建工程菌株W50-AB和W50-EAB。通过摇瓶发酵研究W50-AB和W50-EAB的D-木糖代谢特性。【结果】酶活分析结果表明,xylA和xylB基因在菌株R.eutropha W50中得到表达。摇瓶发酵结果表明,W50-AB在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中的最大比生长速率为0.025 h-1,在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中没有生长;W50-EAB在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中表现出一定生长,在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中最大比生长速率为0.035 h-1。PHB含量分析结果表明,摇瓶发酵终点时,W50-AB和W50-EAB菌株内的PHB含量分别为细胞干重的15.07±1.01%和15.07±1.64%,其相应的D-木糖-PHB转化率分别为0.0920 g·g-1和0.0838 g·g-1,低于两重组菌株利用葡萄糖发酵的糖-PHB转化率(>0.22 g·g-1)。另外,重组菌株W50-AB和W50-EAB在含葡萄糖(0.01 mol/L)和D-木糖(0.09 mol/L)的混合糖培养基中的发酵结果表明,两重组菌株均表现出更高的生长速率和D-木糖消耗速率以及胞内PHB积累量。【结论】来源于E.coli K-12W3110菌株的xylAB基因的表达使R.eutropha W50获得了一定的D-木糖代谢能力,通过D-木糖转运蛋白基因xylE的表达能提高菌株的D-木糖代谢能力,同时重组菌株利用D-木糖能积累一定量PHB。
- 刘凯刘桂明张英姿丁久元翁维琦
- 地中海富盐菌PhaE蛋白乙酰化修饰对其功能的影响
- 2017年
- 【目的】研究地中海富盐菌PHA合酶(Pha EC)中Pha E亚基乙酰化修饰对其功能的影响,探讨乙酰化修饰对菌体生理代谢的调控作用。【方法】蔗糖密度梯度离心收集PHA颗粒,质谱鉴定颗粒结合蛋白Pha E的乙酰化位点。将乙酰化位点(赖氨酸,K)分别突变为精氨酸(R)(模拟去乙酰化)或谷氨酰胺(Q)(模拟乙酰化),利用同源双交换原理,将突变后的基因原位敲入基因组。以野生型为对照,检测突变对菌体生长、葡萄糖消耗和PHA合成能力的影响。利用Western blot检测PHA颗粒上Pha E的含量,进一步分析乙酰化修饰对蛋白功能的影响。【结果】在Pha E蛋白105位和170位赖氨酸(K)2个位点检测到乙酰化修饰。利用遗传操作系统将突变的基因原位敲入,共得到6种突变株。发酵结果表明,任何一种单突变对菌体生长及PHA合成的影响均不明显。但当2个位点同时突变成精氨酸(K105R/K170R)时,突变株生长及合成PHA的能力均受到明显抑制,2个位点同时突变成谷氨酰胺(K105Q/K170Q)则无明显影响。进一步的Western blot结果表明,突变成精氨酸的双突变株的PHA颗粒上,Pha E蛋白的含量相较于野生型约降低了一半。【结论】Pha E蛋白的去乙酰化能够导致菌株利用葡萄糖合成PHA的能力显著降低,其可能原因是降低了Pha E与PHA颗粒或PHA颗粒上Pha C的结合能力,从而降低了Pha EC合酶的活性。
- 姜雄健王前刘桂明赵大贺刘景芳向华
- 关键词：乙酰化突变嗜盐古菌
- 重组菌Ralstonia eutropha W50-EAB D-木糖代谢相关的限速靶点
- 2015年
- 【目的】通过代谢工程改造真养罗氏菌(Ralstonia eutropha)W50-EAB木糖代谢的相关限速靶点,进一步提高R.eutropha W50-EAB的D-木糖利用效率,为获得高效利用纤维素水解液的菌株奠定基础。【方法】利用PCR技术扩增R.eutropha转酮酶基因tkt A,cbb T2和转醛酶基因tal,将扩增的tkt A,cbb T2和tal基因分别构建到表达载体p BBR1MCS-3上,获得重组质粒p WL1-TKT,p WL1-CBBT2,p WL1-TAL。通过电转的方式将质粒分别转化W50-EAB获得重组菌W50-KAB,W50-CAB和W50-TAB。利用基因敲除的方法,获得醛还原酶基因h16_A3186敲除株W50'-EAB。通过电转的方式将重组质粒p WL1-TAL导入敲除株W50'-EAB获得重组菌株W50'-TAB。通过摇瓶发酵研究重组菌株W50-KAB,W50-CAB,W50-TAB,W50'-EAB以及W50'-TAB的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,转酮酶和转醛酶基因实现表达。摇瓶发酵结果表明,转酮酶基因过表达菌株W50-KAB和W50-CAB相比于对照菌株W50-EAB/p3,表现出降低的木糖利用能力;而转醛酶基因过表达重组菌株W50-TAB以及敲除菌株W50'-EAB对木糖的利用得到一定的提高。在0.1 mol/L木糖的发酵培养基中,W50-EAB的最大比生长速率为0.035 h-1,PHB干重比为16.2±1.01%;而W50-TAB的最大比生长速率提高到0.039 h-1,PHB干重比达到20.5±0.76%;醛还原酶基因敲除菌株W50'-EAB最大比生长速率提高到0.040 h-1,PHB含量提高到19.8±1.05%。结果显示转醛酶基因的过表达与醛还原酶基因的敲除对木糖利用均表现出一定的优势,将这两种优势组合获得菌株W50'-TAB,摇瓶发酵分析结果为最大比生长速率达到0.042 h-1,PHB积累达到27.9±0.47%,相比于对照菌株提高了72.2%。另外,在含有葡萄糖(0.01 mol/L)和木糖(0.09 mol/L)的混合糖培养下,重组菌株W50-TAB,W50'-EAB和W50'-TAB相比于在纯木糖培养下都表现出更高的生物量和胞内PHB积累量。【结论】磷酸戊糖途径关键酶转醛酶基因的过表达加速了木糖代谢流,从而
- 王露刘桂明张英姿王宇丁久元翁维琦
- 生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用
- 本发明公开了生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明的基因工程菌是真氧罗氏菌的基因缺失株或将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码...
- 丁久元张英姿刘桂明翁维琦刘双江
- 文献传递
- 一种聚羟基烷酸颗粒降解酶其用途及(R)-3HB生产方法
- 本申请公开一种聚羟基烷酸颗粒降解酶其用途及(R)‑3HB生产方法。本发明的聚羟基烷酸颗粒降解酶PhaZh1或多肽，其中所述酶具有序列表中序列8所示的氨基酸序列，所述多肽与所述酶具有至少70％，优选80％，进一步优选90％...
- 向华刘桂明韩静赵大贺
- 文献传递
- 来源于谷氨酸棒杆菌的启动子及其应用
- 本发明公开了一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)：1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且...
- 丁久元刘桂明李开赵智王宇张英姿
- 文献传递
- 谷氨酸棒杆菌10147基因组中启动子活性片段的克隆与分析被引量：8
- 2009年
- 【目的】获得谷氨酸棒杆菌10147基因组中具有启动子活性片段的结构序列,为构建表达载体做准备。【方法】利用启动子探测载体pAKC6,采用鸟枪法克隆经过限制性内切酶Sau3A I完全酶切的谷氨酸棒杆菌10147染色体DNA片段,并测定pAKC6上报告基因编码的氯霉素乙酰转移酶(CAT)的比活力,以筛选有启动子功能的片段。【结果】共克隆到30个具有启动子功能的片段。其中有3个插入片段启动的氯霉素乙酰转移酶比活力大于24 U/mg,插入片段F57启动的CAT比活力为32.50 U/mg;而插入有启动子Ptrc的阳性对照的CAT比活力为26.33 U/mg。【结论】获得3个DNA插入片段具有与已知启动子Ptrc相当的启动活性,这些片段可以用于构建谷氨酸棒杆菌表达载体。
- 刘桂明赵智张英姿王宇丁久元
- 关键词：谷氨酸棒杆菌启动子
