目的：观察慢病毒载体转染离体兔角膜基质细胞的有效性及对细胞活性的影响。方法：转染组用慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白（Lentivirus-enhanced green fluorescent proteins,Lenti-EGFP）转染细胞,对照组则加入空白培养液,在不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）及感染后不同时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率;RT-PCR检测EGFP mRNA的表达;MTT比色法和流式细胞技术（Flow cytometer,FCM）检测病毒对细胞增殖和凋亡的影响。结果：Lenti-EGFP转染细胞后从48h开始可见绿色荧光,在MOI=500时,转染后第5天转染率可达51%;RT-PCR检测转染组有EGFP的mRNA表达;MTT结果显示在MOI为1~500时,漫病毒不影响细胞的增殖;在MOI=500时,FCM检测慢病毒载体对细胞凋亡无影响。结论：慢病毒载体可以在体外稳定有效转染兔角膜基质细胞且不影响细胞活性,是角膜基质细胞理想的基因转染载体。
目的观察慢病毒载体(lentiviral vectors,LVs)用于兔角膜上皮细胞基因转染的有效性。方法兔角膜上皮细胞的原代及传代培养并做细胞鉴定;慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI=0、1、10、50、100、500)转染实验细胞,寻找最佳转染剂量;于转染后24、48、72、96h运用倒置荧光显微镜观察不同MOI下增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的表达并计算细胞转染率;RT-PCR方法检测EGFP基因的表达情况。结果 EGFP于转染48h即开始有表达,随着转染时间的延长其表达增强。MOI=1、10、50、100时,角膜上皮细胞转染率随着感染复数的增加而增加,分别为(4.5±0.6)%、(30.4±0.9)%、(51.9±1.4)%、(75.4±0.7)%,各组间差异显著(P<0.05);MOI在100与500时,转染率差异不显著(P>0.05),即最适感染复数为100。RT-PCR结果提示转染细胞组EGFP基因有表达。结论慢病毒载体能够有效转染离体兔角膜上皮细胞。
目的:观察慢病毒载体(Lentivirus vectors,LVs)介导的增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,eGFP)基因转染离体兔角膜上皮细胞对其生理功能的影响。方法:角膜上皮细胞的原代及传代培养并细胞鉴定。分正常细胞组(对照组)与转染细胞组。LVs介导的eGFP基因(Lenti-eGFP)以最适感染复数(Multiples of infection,MOI)=100转染角膜上皮细胞并成功传代,倒置荧光显微镜观察eGFP的表达情况。HE染色光镜观察及透射电子显微镜观察2组细胞的形态及超微结构变化;计算2组细胞在传代第2、3、4天的细胞增殖率;流式细胞技术(Flow cytometer,FCM)检测2组角膜上皮细胞凋亡率的变化。结果:eGFP于转染48 h即开始有表达,随着转染时间的延长其在角膜上皮细胞内的表达增强。细胞成功传代后,eGFP仍明显表达于角膜上皮细胞。在最适感染复数,即MOI=100时,HE染色光镜观察见转染组细胞形态规则,无异常核分裂像,与对照组角膜上皮细胞形态一致;透射电子显微镜观察转染组细胞超微结构与对照组细胞无明显差别。2组细胞分别在传代第2、3、4天的增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。FCM检测细胞凋亡率2组间无明显差异(P>0.05)。结论:Lenti-eGFP可以有效转染离体兔角膜上皮细胞,但对上皮的影响需要进一步探讨。
