张健康
- 作品数：12 被引量：8H指数：2
- 供职机构：山西医科大学第一医院更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达
- 2007年
- 目的:克隆乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其原核表达载体,诱导在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及生物信息学(bioinformat-ics)技术从HepG2细胞提取的cDNA模板中扩增获得HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-T-easy载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化进BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导HBeBP4A融合蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析鉴定证实表达蛋白的特异性。结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因HBeBP4A,并将其插入pET-32a(+)原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了HBeBP4A重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论:发现了乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pET-32a(+)-HBeBP4A原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a(+)-HBeBP4A重组蛋白的表达。
- 张健康郭江成军伦永志王丹琼赵龙凤蓝贤勇洪源毛羽
- 关键词：E抗原结合蛋白剪切体生物信息学原核表达
- 应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选PS1TP5反式激活相关基因
- 2009年
- 目的构建乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5(PS1TP5)的反式激活相关基因差异表达的cDNA,克隆PS1TP5蛋白反式激活相关基因。方法以PS1TP5表达质粒pcDNA3.1(-)-myc-his(A)-PS1TP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建人PS1TP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到70个200～1 000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得24种编码基因,其中1个为未知功能的新基因,电子拼接后命名为HBV PS1TP5TP1(乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5反式激活蛋白1),GenBank注册号DQ487761。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。PS1TP5与人类免疫调节、物质代谢、信号转导、肝纤维化形成、肿瘤发生发展有密切关系。为进一步研究HBV前-S1蛋白的功能提供了新的线索。
- 张健康刘春燕成军郭江赵龙凤洪源毛羽
- 关键词：乙型肝炎病毒前-S1蛋白抑制性消减杂交
- 乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5的筛选克隆与重组蛋白诱导表达
- 2008年
- 目的克隆人类乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因PS1TP5。构建其原核表达载体,并诱导其在大肠埃希菌中表达。方法以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)作为平行对照,提取mRNA进行抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术分析,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选得到人类新基因PS1TP5。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得PS1TP5基因片段,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化进BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得了PS1TP5重组蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析证实表达蛋白的特异性。结果成功扩增出PS1TP5基因。并将其插入pET-32a(+)原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了PS1TP5重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论应用SSH、RT-PCR与生物信息学技术筛选克隆出PS1TP5基因,构建了pET-32a(+)-PS1TP5原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a(+)-PS1TP5重组蛋白的表达。为进一步研究PS1TP5免疫原性及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。
- 张健康郭江成军王丹琼赵龙凤李康洪源毛羽
- 关键词：乙型肝炎病毒前-S1蛋白基因克隆大肠埃希菌
- HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究
- 2007年
- 目的在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因。方法以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析。结果成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列。酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD。结论成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达。
- 张健康成军郭江刘春艳赵龙凤洪源
- 关键词：剪切体基因表达
- 乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5在酵母细胞中的表达
- 2007年
- 目的在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5(PS1TP5)。方法以HepG2细胞来源的mRNA为模板,经RT-PCR法扩增PS1TP5基因,克隆到pGEM-T载体中,并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中,并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析,以明确PS1TP5是否可在其中表达。结果成功扩增出PS1TP5,测序鉴定符合基因库报告序列,酶切回收的PS1TP5基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7,并转化入酵母细胞AH109中,Western免疫印迹显示该基因在酵母细胞中成功表达,表达产物相对分子质量为36950。结论成功构建了PS1TP5酵母表达载体,并在酵母细胞中表达。
- 张健康成军郭江伦永志王丹琼赵龙凤洪源毛羽
- 关键词：前S1蛋白酵母菌基因表达
- 乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5在酵母细胞中的表达研究
- 目的:为探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S1(pre-S1)蛋白反式激活基因5(PS1TP5)的功能,在真核生物酵母细胞中表达PS1TP5基因。方法:以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-P...
- 张健康成军郭江伦永志王丹琼赵龙凤洪源毛羽
- 文献传递
- 丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的表达纯化及多克隆抗体制备被引量：3
- 2008年
- 目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活基因2(FTP2)的原核表达载体并诱导其表达,制备多克隆抗体并探讨其在临床病理组织中表达的意义。方法通过PCR获得HCVFTP2基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)上,构建重组表达载体,在大肠埃希菌BL21中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blotting验证后进行大量表达并纯化。将纯化的重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,并将此抗体作为诊断试剂观察其在正常肝组织和临床病理组织中的表达情况。结果以pET32a(+)-FTP2表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得大量重组蛋白,分子量约为25kD。将此重组蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,经抗体间接ELISA检测证明,多克隆抗体效价>1:128000,免疫组化显示多克隆抗体能够与丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等临床病理组织产生FTP2抗原反应。结论成功表达了HCV的FTP2蛋白并制备了其多克隆抗体,证实FTP2与丙型肝炎、肝硬化的发病机制密切相关。
- 王丹琼郭江成军张健康赵龙凤洪源张黎颖
- 关键词：肝炎病毒原核表达
- HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体构建及表达研究
- 目的:为探讨乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的功能,在真核生物酵母细胞中表达HBeBP4A基因。方法:以pcDNTM3．1／myc-HisA-HBeBP4A重组质粒(本室构建)作为模板, 经过逆转录聚...
- 张健康成军郭江伦永志王丹琼赵龙凤洪源毛羽
- 文献传递
- 乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的克隆、表达及功能被引量：5
- 2008年
- 目的应用原核表达系统表达HBV前S1蛋白反式调节基因2（PS1TP2），酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与之结合的蛋白质，了解该基因产物在肝癌细胞系中的亚细胞定位。方法应用生物信息学初步探讨PS1TP2结构及功能。PCR扩增PS1TP2基因，构建pET32a（＋）-PS1TP2表达载体，在大肠埃希菌Rosettap中进行诱导表达。构建pGBKT7-PS1TP2重组载体，应用酵母双杂交技术，在营养缺陷型培养基上筛选白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质。构建pEGFPC1-PS1TP2表达质粒，转染肝癌细胞株HepG2，利用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察PS1TP2的亚细胞分布。结果PS1TP2基因位于6q24．1，疏水指数较高。PS1TP2能在原核系统中表达，表达产物相对分子质量约4．1×10＾4。酵母双杂交技术筛选出白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质26个。PS1TP2亚细胞定位于细胞质中。结论在原核表达系统中成功表达了PS1TP2，为抗体的制备奠定了基础。PS1TP2可与白细胞表达的某些蛋白质相互作用，在肝癌细胞系中定位于细胞质，为进一步探究HBV感染的发病机制提供了新线索。
- 王丹琼郭江成军张健康赵龙凤洪源张黎颖
- 关键词：生物信息学原核表达酵母双杂交
- HBeAg结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆化
- 2006年
- 目的:克隆HBeAg结合蛋白未知功能新基因 HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能．方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增HBeBP4基因的剪切体基因 HBeBP4A,选用pGEM-Teasy载体进行TA 克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体 pcDNATM3．1/myc-HisA,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质,蛋白质结构和功能．结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因,命名为HBeBP4A．利用生物信息学分析推定其 ORF为1104个核苷酸(nt),编码产物为367个氨基酸残基(aa)．结论:发现了HBeAg结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pcDNATM3．1／ myc-HisA真核表达载体．
- 张健康郭江成军王丹琼伦永志赵龙凤蓝贤勇洪源毛羽
- 关键词：乙型肝炎病毒E抗原结合蛋白克隆化
