冯昌增
- 作品数：27 被引量：26H指数：3
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所更多>>
- 发文基金：云南省科技计划项目国家科技重大专项云南省科技厅科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 果蝇吡咯啉-5-羧酸还原酶的表达、纯化及理化特点被引量：2
- 2012年
- 吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CRs)是普遍存在于原核和真核生物中的一种重要管家蛋白,其主要的功能是催化吡咯啉-5-羧酸(P5C)转化为脯氨酸,同时将NAD(P)H氧化为NAD(P)+。为揭示果蝇P5CR的聚合形式、酶学性质及晶体结构,提取了果蝇的总RNA,通过逆转录获得了cDNA,进而通过PCR获得了编码果蝇P5CR的cDNA片段;将此片段连接到pET-28a(+)载体上,在大肠杆菌(Escherichia coli)中得到了高效表达,依次经过硫酸铵分级沉淀、亲和层析及凝胶过滤层析得到了适合晶体生长的高纯度蛋白;通过EGS交联实验和凝胶过滤层析检测了P5CR在溶液中的聚合形式;应用分光光度法测定了果蝇P5CR的酶活性参数;采用悬滴气相扩散法筛选了P5CR的结晶条件并进行了优化。实验结果:(1)纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE检测,结果显示,凝胶上已基本观察不到杂蛋白质条带,说明目的蛋白质纯度较高;(2)果蝇P5CR在溶液中的基本存在形式是十聚体,在此基础上可形成更大的聚合形式;(3)果蝇P5CR参与抗癌药物硫代脯氨酸的代谢,在该逆向反应中最适pH为高碱性,该酶在45℃的半衰期约15分钟;(4)筛选得到了果蝇P5CR的初步结晶条件(0.2mol/L Ammonium phosphate dibasic,20%PEG3350 pH 8.0)。
- 冯昌增谢月辉曹毅孟照辉
- 关键词：还原酶果蝇羧酸吡咯纯化凝胶过滤层析
- 2019年云南省昆明市柯萨奇病毒A组4型毒株分离鉴定及其VP1基因特性分析被引量：2
- 2022年
- 目的对2019年云南省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)患者粪便中分离获得的柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株的VP1基因遗传特征进行分析。方法利用人横纹肌肉瘤RD细胞、人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞分离病毒,以病毒RNA作为逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)的模板,扩增病毒完整VP1基因,利用MEGA 6.06和Geneious 9.0.2等软件对VP1序列进行分析。结果选取8株CV-A4分离株进行分析,其完整VP1序列为915 bp,编码305个氨基酸。8株CV-A4云南分离株与CVA4/High Point/USA/1949/AF081295(简称原型株)的核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为83.4%~84.6%和97.0%~98.0%;与其他国内CV-A4参考株相比,核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为87.7%~97.0%和97.7%~99.3%。8株CV-A4云南分离株相互比对,核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为91.0%~99.9%和97.7%~100.0%。CV-A4云南分离株与大部分中国分离株同属C2基因亚型。结论本研究中CV-A4分离株均是中国大陆地区优势流行株。
- 丛山日刘红波许丹菡张名冯昌增黄小琴孙浩杨昭庆马绍辉
- 关键词：进化分析
- 云南省1株柯萨奇病毒A组8型分离株全基因组分析
- 2024年
- 目的分析柯萨奇病毒A组8型(Coxsackievirus A8,CVA8)云南分离株A8-1/YN/CHN/2019全基因组序列及其遗传特性,以期了解CVA8的流行和变异情况。方法设计针对CVA8的引物,提取病毒RNA,RT-PCR扩增VP1序列并测序,BioEdit 7.2.3拼接得到全基因组,使用MEGA 7.0软件进行系统进化分析,应用Simplot 3.5.1及RDP4软件进行重组分析。结果A8-1/YN/CHN/2019株长7396 nt,编码2188个氨基酸。其VP1与CVA8原型株AF081299/Donovan/USA/1998核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为81.04%和95.24%;A8-1/YN/CHN/2019株属于基因型E,其他中国分离株位于D和E型。重组分析发现A8-1/YN/CHN/2019株在非结构编码区的P2和P3段上发生重组。结论A8-1/YN/CHN/2019株为E基因型,并在P2、P3段的非结构区发生了重组事件。
- 郭伟刘煜菡张名冯昌增许丹菡何秀莲范胜涛马绍辉
- 关键词：全基因组测序
- 一种柯萨奇病毒B组1型毒株及应用
- 本发明公开了一种柯萨奇病毒B组1型毒株，毒株命名为KM7‑X29，于2022年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202213，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，该毒株利用Vero细胞进行培...
- 马绍辉张名许丹菡冯昌增王晓辉郭伟刘煜菡杨昭庆孙浩
- 一种柯萨奇病毒B组4型毒株及应用
- 本发明提供一种柯萨奇病毒B组4型毒株及其应用。该毒株命名为KM140‑G01，于2023年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202356，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。该毒株是一种人...
- 马绍辉冯昌增张名郭伟刘煜菡王晓辉杨昭庆和占龙孙浩叶尤松
- RD、KMB-17及Vero细胞对肠道病毒分离培养敏感性的比较
- 2024年
- 目的比较人横纹肌肉瘤细胞RD、人胚肺二倍体细胞KMB-17和非洲绿猴肾细胞Vero对肠道病毒(enterovirus,EV)分离培养的敏感性,以期为后续EV各基因型毒株的分离提供实验依据。方法收集2019年昆明市某医院确诊手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患者粪便样本60份,分别采用RD、KMB-17和Vero细胞分离培养EV,并对阳性样本进行RT-PCR检测、测序及NCBI BLAST比对,鉴定EV基因型。结果共分离获得112株EV,分别属于11种基因型。其中RD细胞分离出26株Echo-11,6株Echo-6和Echo-30,2株CV-A4和CV-A10,1株CV-A6、CV-A16和Echo-18;KMB-17细胞分离出42株Echo-11,3株Echo-6和2株Echo-30;Vero细胞分离出6株CV-B1,5株CV-B3,4株Echo-11,3株CV-A16和1株CV-B2。结论RD细胞对大部分EV均敏感,KMB-17和Vero细胞分别对Echo和CV-B最敏感。
- 刘煜菡张名许丹菡郭伟冯昌增徐丽兰马绍辉
- 关键词：肠道病毒细胞敏感性VERO细胞RD细胞
- 云南株埃可病毒6型的全基因序列分析
- 2023年
- 目的对分离自云南省手足口病患者粪便的8株埃可病毒6型(Echovirus 6,E6)进行全基因组遗传特征分析,为E6基因组的变异和重组研究提供数据参考。方法分别采用人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma cells,RD)、人胚肺二倍体成纤维细胞(human embryonic lung diploid fibroblasts,KMB17)以及非洲绿猴肾细胞(Vero)对云南省2019年从手足口病患者粪便样分离的8株E6进行增殖培养。提取病毒RNA,RT-PCR扩增其VP1序列,并鉴定其血清型。设计针对E6的引物,分段扩增获得全基因组并测序,使用Mega 7.0、Geneious 9.1.4及Simplot 3.5.1等软件对其全基因组序列进行分析。结果8株E6分离株中RD细胞分离的病毒6株,KMB17细胞分离的病毒2株,Vero细胞未分离到病毒。8株E6病毒分离株基因组全长为7440~7450个核苷酸,编码2191个氨基酸,8个分离株之间全基因组核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.6%~99.8%和99.4%~99.9%。VP1序列分析显示,8个E6分离株均属于中国流行的优势基因型F。基于P1、P2、P3系统进化与重组分析显示:在P1区,8个E6分离株与E6原型株DAmori聚在一起,与VP1分型结果一致;在P2区,与柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CVB5)、埃可病毒16型(Echovirus 16,E16)以及2个中国E6毒株聚类在一起;在P3区,与柯萨奇病毒A组9型(Coxsackievirus A9,CVA9)、E16和其他中国E6病毒分离株聚类在一起,表明8个E6病毒分离株与EV-B的其他血清型病毒之间可能发生过重组。结论8个云南分离株E6病毒均属于中国流行的优势基因型F,且与EV-B的其他血清型之间可能发生过重组事件。
- 陈俊薇张名刘煜菡郭伟冯昌增马绍辉
- 关键词：全基因组序列系统进化分析
- 2019年云南省手足口病相关的柯萨奇病毒A组10型分离株的全基因组分析被引量：2
- 2022年
- 目的分析2019年云南省昆明市手足口病相关的2株柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CVA10)分离株3R3/YN/CHN/2019(简称3R3)和4R3/YN/CHN/2019(简称4R3)的基因组特征。方法对云南省2019年2例手足口病患儿的临床样本中分离到的2株CVA10毒株进行全基因组序列测定。利用MEGA7.0.26、Geneious9.1.4和SimPlot3.5.1软件分析全基因序列。结果3R3和4R3毒株的基因组全长均为7413 nt,全基因组核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.5%和99.4%。与CVA10原型株AF081300/Kowalik/USA全基因组进行比对分析,核苷酸序列相似性均为79.6%,而氨基酸序列相似性分别为95.1%和95.3%;与其他中国大陆CVA10全基因组序列的核苷酸相似性为93.2%~98.2%,氨基酸相似性为98.5%~99.4%。进化分析发现,2株毒株与近年来中国大陆CVA10流行株同属F基因型,位于F3亚型,与分离株KF999764/JL12-51/CHN/2012的同源性最高,形成一个小分支。经Simplot软件分析未发现明显的基因重组。结论3R3和4R3株属F3基因亚型。CVA10在中国大陆有不同传播链存在。
- 许丹菡郭伟张名冯昌增唐靖月马绍辉
- 关键词：手足口病全基因组进化分析
- 诺如病毒VP1蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达及纯化
- 2022年
- 目的 使用马克斯克鲁维酵母表达系统对GII.17型诺如病毒病毒样颗粒(VLPs)进行表达并对该蛋白纯化方式进行初步探讨。方法 对诺如病毒VP1序列进行密码子优化,使用双酶切构建重组质粒,通过醋酸锂转化法筛选获得重组阳性克隆KM-NOV-GII.17。摇瓶培养72 h后对菌体进行破碎,使用层析柱对目的蛋白进行纯化,并通过电镜观察颗粒形态。结果 成功筛选出高表达量KM-NOV-GII.17,通过Q柱及分子筛串联纯化的方式获得了纯度较高的病毒样颗粒,产量约为0.26 g/L,电镜观察结果显示该VP1序列可自组装为大小均一的病毒样颗粒并且与天然病毒颗粒形态相似。结论 本研究证实了GII.17型诺如病毒VP1蛋白可通过马克斯克鲁维酵母表达系统获得产量高、均一性好的病毒样颗粒,这为诺如病毒基因重组疫苗的研发提供了新的蛋白表达系统。
- 袁军鸿王晓辉吴萍萍冯昌增周峻岗周峻岗褚嘉祐杨昭庆
- 关键词：诺如病毒病毒样颗粒马克斯克鲁维酵母纯化
- 2016年云南省埃可病毒7型分离株K1641/YN/CHN/2016全基因组序列分析
- 2022年
- 目的 对2016年云南省埃可病毒7型(echovirus 7,E-7)的分离株K1641/YN/CHN/2016(简称K1641)进行全基因组序列测定并分析其分子变异和遗传进化特性。方法 利用KMB17细胞分离病毒,提取病毒RNA,进行RT-PCR,并测序拼接获得全基因组序列。利用Mega 5、Geneious Basic 5.4.1和SimPlot 3.5.1等软件分析全基因组序列。结果 获得的K1641株全基因组序列长度为7 428 bp,编码含2 193个氨基酸的多聚蛋白。K1641全基因组核苷酸和氨基酸同源性与中国分离株40/Longyou/ZJ最为同源,分别为95.9%和98.9%;而与其他中国E-7流行株VP1的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.1%~99.7%和82.5%~99.3%;与原型株VP1的核苷酸和氨基酸同源性为78.4%和93.1%。K1641与其他E-7毒株的各区段核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为73.5%~97.3%和85.3%~100.0%,K1641与40/Longyou/ZJ的各区段核苷酸一致性和氨基酸同源性均超过90.0%,并且,氨基酸的同源性要高于核苷酸一致性。基于E-7全长VP1序列的种系进化分析,可分为8个簇,本次分离株K1641与2013中国分离株40/Longyou/ZJ关系较近,属于进化树上的一个分支。进行相似性分析,在位置350~600,与E-6/RO-24-9-79(LS451294)显示出99%的高相似性;其他位置与中国分离株40/Longyou/ZJ有较高(>92%)的相似性。结论 K1641分离株为E-7,与E-6/RO-24-9-79株可能存在重组事件发生,对E-7遗传特性研究具有参考意义。
- 张名许丹菡冯昌增郭伟王晓辉何陆涛马绍辉
- 关键词：全基因组种系发生
