王小凡
- 作品数：16 被引量：22H指数：3
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技攻关计划国家高技术研究发展计划更多>>
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- PrP八肽重复突变体对细胞生长影响的探讨
- 2007年
- 目的探讨PrP八肽重复突变体对细胞生长的影响。方法将具有遗传性朊病毒病相关不同八肽重复区插入突变的PRM，基因表达载体瞬时转染HeLa细胞，经噻唑蓝比色法（MTT）、Annexin—V／PI双染流式细胞检测。结果多八肽突变PrP蛋白对细胞的毒性作用较野生型明显增强。多八肽突变PrP较野生型更容易诱导凋亡发生，多八肽突变组早、晚期凋亡率均高于野生组。结论遗传性朊病毒病相关多八肽突变PrP蛋白可能较野生型更易诱导细胞凋亡发生。
- 韩露万言珍韩俊陈岚孙力王小凡黄银霞董辰方姜慧英董小平
- 关键词：朊病毒肽类噻唑蓝比色法细胞凋亡
- 鼠源抗haPrP23—231噬菌体抗体库的构建和初步鉴定
- 2007年
- 目的构建和鉴定鼠源抗haPrP23—231噬菌体抗体库。方法利用纯化的朊蛋白抗原免疫BALB／c小鼠，取脾，提取细胞总RNA，逆转录cDNA，以其为模板进行免疫球蛋白Fab区基因的特异性PCR扩增，将轻链和重链Fd段基因分别构建到pComb3质粒，构建噬菌体抗体库。结果经过四轮“吸附-洗脱-富集”的过程后获得了12株阳性克隆。挑取5株进行序列分析，并将结果与GenBank中已知序列库中的IgG序列进行比较，得到了两株不同的抗体，并进行了初步鉴定。结论本研究为朊病毒病的研究奠定了基础。
- 黄银霞韩俊董辰方孙力高晨王小凡韩露周伟张宝云姜慧英梁米芳董小平
- 关键词：朊病毒肽库细菌噬菌体
- PrP及其缺失突变体与GFAP体外相互作用的初步研究
- 2007年
- 目的研究PrP蛋白与GFAP蛋白是否发生分子间相互作用以及PrP蛋白多肽链中与GFAP蛋白相互作用的区域。方法制备仓鼠脑组织匀浆上清，通过原核表达系统以及体外翻译系统表达了全长的小鼠GFAP蛋白、人PrP蛋白以及各种缺失突变体，利用Pull-down及免疫共沉淀实验检测PrP与GFAP的分子间相互作用。结果不仅重组的GFAP与PrP发生分子间的相互作用，而且脑组织中的GFAP与prpc及Prp也发生相互作用。PrP与GFAP蛋白相互作用的区域位于PrP的C端第91至231位氨基酸。结论PrP及其缺失突变体与GFAP在体外能够发生分子间的相互作用，提示GFAP可能参与朊蛋白的正常生理功能或者朊病毒病的病理过程。
- 董辰方单冰王小凡韩俊董小平
- 关键词：朊病毒分子诊断技术
- 微管相关蛋白tau与朊蛋白的相互作用被引量：6
- 2006年
- 微管相关蛋白tau参与了许多神经退行性疾病的发生, 其中包括一些人类可传播性海绵状脑病. 为了探讨tau与朊蛋白（PrP）之间可能存在的关系, 首先通过GST pull-down和免疫共沉淀等技术发现重组tau蛋白可通过微管结合区与来源于正常叙利亚仓鼠脑组织中的正常细胞膜朊蛋白（PrP^C）和羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织的异常朊蛋白（PrP^Sc）相结合. 利用免疫共沉淀实验发现在正常和羊瘙痒因子感染的仓鼠脑组织中存在tau蛋白与PrP^C和PrP^Sc的相互作用, 并且利用激光共聚焦方法检测到PrP和tau蛋白在CHO细胞内具有共定位的关系. 为了确定PrP与tau蛋白相互作用的部位, 构建了不同区域的PrP片段, 从而证明PrP与tau蛋白相互作用的区域位于PrP的N端序列（23～91 aa）. PrP与tau蛋白分子间相互作用的直接实验证据提示tau蛋白可能参与PrP的正常生理功能以及朊病毒病的病理过程.
- 韩俊张瑾姚海兰王小凡李锋高晨周伟张宝云董小平
- 关键词：朊蛋白蛋白相互作用
- 帕金森病相关蛋白α-共核蛋白的可溶性表达、纯化及抗体制备被引量：1
- 2006年
- 目的利用分子克隆技术在原核细胞中表达α-共核蛋白(SNCP),并制备兔多克隆抗体。方法从人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA。利用PCR技术扩增获得SNCP的cDNA序列,测序正确后克隆至pQE-30-GST表达载体上,在大肠埃希菌中表达GST-SNCP融合蛋白。融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备特异性抗血清,并对该抗体进行检测。结果琼脂糖凝胶电泳显示获得的SNCP cD-NA序列为420 bp。SDS-PAGE和W estern b lot分析,表达的融合蛋白呈可溶性,相对分子质量约为45 000。以其为抗原制备的SNCP抗血清的ELISA效价达到1:32000,并且该抗体可与BALB/c小鼠脑组织中内源性SNCP发生特异性反应。结论人SNCP可在原核细胞中可溶性表达。用表达的蛋白制备获得特异性较好的SNCP抗血清,为进一步了解SCNP的结构和功能以及在中枢神经系统退行性疾病的作用提供了必要的实验基础。
- 黄银霞韩俊张晓光姚海兰王小凡张瑾张宝云董小平
- 关键词：Α-共核蛋白神经退行性变原核表达抗体制备
- 一例家族性CJD朊蛋白特性分析及PrP与tau蛋白相互作用的研究
- 可传播性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies，TSEs）即朊病毒病（prion diseases），是一类罕见的致死性神经系统退行性疾病，包括人类的克雅氏病（Cr...
- 王小凡
- 关键词：朊病毒免疫共沉淀
- 文献传递
- Tau融合蛋白及其缺失突变体与朊蛋白的体外作用分析被引量：1
- 2006年
- 在部分朊病毒病(priondiseases)中,高度磷酸化的微管相关蛋白tau与朊蛋白(prionprotein,PrP)发生共定位,tau蛋白可能在朊病毒病的病理机制中有重要作用.本室已经证明二者可以发生分子间相互作用,本文进一步分析了tau蛋白与prion的体外相互作用及作用位点.利用RTPCR方法从人源细胞系SHSY5YcDNA中扩增出微管相关蛋白tau全长cDNA序列,克隆至质粒pGEX2T载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白GSTtau.利用GSTpulldown及免疫共沉淀方法检测全长tau蛋白与PrP23231的分子间相互作用.进一步表达tau蛋白的各种缺失突变体,确定tau蛋白与PrP蛋白的相互作用位点.结果表明,所表达的全长tau蛋白及各种缺失突变体均为可溶性蛋白,Western印迹结果显示,各种蛋白均能很好的被tau蛋白单抗识别.GSTpulldown和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的全长tau蛋白可与全长的PrP蛋白在体外发生相互作用,并确定相互作用位点位于tau蛋白的N端序列及中段的重复区.上述结果为研究tau蛋白与PrP的相互作用在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的理论基础.
- 王小凡韩俊董辰方韩露万言珍李锋安润董小平
- 关键词：朊蛋白分子间相互作用
- PrP的胞内运输与朊病毒病被引量：3
- 2005年
- 朊病毒病,即传染性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs),是一类致死性的神经退行性疾病,存在散发性、感染性和遗传性3种形式。在朊病毒病的病理过程中,细胞正常朊蛋白PrPC(cellularPrP)转化为异常构象的PrPSc(scrapiePrP)是至关重要的,但是朊病毒的增殖如何导致神经元凋亡仍不清楚。PrPC的胞内运输在朊病毒病中发挥重要作用,朊病毒感染后PrPC转化为PrPSc,及遗传性朊病毒病中PrP突变可能影响PrP的生物合成、亚细胞定位及转运过程,通过干扰PrPC的正常功能或产生毒性中间体而导致神经系统病变。现对近年来关于PrP胞内运输在朊病毒病中的作用进行综述。
- 王小凡韩俊高建梅万言珍李锋董小平
- 关键词：朊病毒病传染性海绵状脑病神经退行性疾病亚细胞定位病理过程
- 一种新型原核表达载体的构建及应用被引量：6
- 2004年
- 目的 利用基因重组技术构建一种新型原核表达载体 ,使之表达带有His和GST标签的融合蛋白。方法以质粒 pGEX为模板 ,将PCR扩增出的GST基因插入到载体 pQE 30中构建pQE 30 GST ,经IPTG诱导GST蛋白表达并用Westernblot鉴定。分别将huNSE188 35 4、huPrP2 3 91和huDoppel2 4 15 2基因插入 pQE 30 GST ,转化 E coliM15并诱导表达融合蛋白。采用NiSepharose 4B和 (或 )GlutathioneSepharose 4B纯化融合蛋白 ,并用羟胺裂解。 结果 重组表达载体 pQE 30 GST可有效地表达各种His GST融合蛋白 ,并可用两种方法纯化不同大小的融合蛋白 ;利用羟胺可将目的蛋白肽段与His GST蛋白有效裂解。结论 新型原核表达载体pQE 30 GST可进行多种蛋白质的表达 ,表达的蛋白质可经两种方法纯化以提高蛋白质的纯度 ,融合蛋白可经羟胺裂解获得目的蛋白质单体。
- 姚海兰聂凯韩俊肖新莉陈岚王小凡周伟姜慧英蔡昌学董小平
- 关键词：GST融合蛋白原核表达载体基因插入NSEIPTG
- 微管相关蛋白Tau与朊蛋白PrP的相互作用的研究
- ＜正＞微管相关蛋白tau被认为与某些prion疾病发病有关,我们利用RT-PCR技术,从人神经母细胞瘤系SSY-5Y克隆出tau微管结合区序列;亚克隆至原核表达载体pGEX-2T,纯化出重组tau蛋白,制备了tau多克隆...
- 韩俊张瑾姚海兰王小凡李锋陈岚高晨高建梅聂凯董小平
- 关键词：TAUPRP微管蛋白蛋白相互作用
- 文献传递
