黄文俊
- 作品数：5 被引量：1H指数：1
- 供职机构：西南医科大学心血管医学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金泸州市科技局基金四川省教育厅资助科研项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 异丙酚对表达在HEK293细胞上的大电导钙激活钾(BKCa)通道的作用
- 2017年
- 目的:研究异丙酚对表达在HEK293细胞上的BK_(Ca)通道的作用,探讨异丙酚降低血压的作用机制。方法:将含有人血管平滑肌BK_(Ca)通道α亚单位(h Slo1)的表达质粒pc DNA3.1-h Slo1使用脂质体转染法(lipofectamine 2000)转染至培养的HEK293细胞,使用膜片钳全细胞和单通道记录方式研究异丙酚对BK_(Ca)通道的作用。结果:在全细胞构型下,56μM异丙酚能够明显增加BK_(Ca)宏观电流(P<0.01或P<0.05),在膜电位(Vm)为+60 mV时,56μM异丙酚明显增加BK_(Ca)宏观电流密度(87.29±7.10 pA/pF到131.21±9.68 pA/p F,n=6),两组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。在内面向外式膜片下,56μM异丙酚能够明显增加BK_(Ca)单通道开放概率(0.015±0.002到0.066±0.013,n=10),两组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:异丙酚能够明显激活表达在HEK293细胞上的BK_(Ca)通道,BK_(Ca)通道的激活可能参与了异丙酚介导的血管舒张。
- 刘雪茹刘力程俊黄文俊谭晓秋
- 关键词：异丙酚大电导钙激活钾通道血管张力
- 用重叠PCR策略构建抑制NF-κB活性的IKBA基因突变体
- 2017年
- 目的:用重叠PCR方法将IKBA基因三个碱基进行点突变A94G、G95C、T106G。方法:根据重叠PCR原理设计IKBA基因两条末端引物及A94G、G95C、T106G突变引物,从HUVEC细胞克隆IKBA基因,将其作为模板进行第一次PCR,将第一次PCR产物稀释10 000~50 000倍后作为模板,扩增突变体IKBAm,并克隆到p LVX-IRES-Zs Green载体,用双酶切及DNA测序筛选阳性质粒。结果:从HUVEC细胞克隆的IKBA基因及其突变体IKBAm基因长度均为954 bp,编码317个氨基酸,与IKBA基因相比,突变体IKBAm基因3个位点发生突变94A→G,95G→C,106T→G,编码的32/36位氨基酸由Ser突变为Ala。结论:成功克隆人IKBA基因及其32/36 Ser→Ala突变体IKBAm。
- 毛亮黄文俊黄鹂李雪党喜同
- 关键词：重叠PCR点突变NF-ΚB
- 可诱导稳定表达大电导钙激活钾通道的细胞系构建及蛋白质纯化
- 2017年
- 目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BK_(Ca))的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化。方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,用潮霉素B筛选建立稳定表达的单克隆细胞系。BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后,用anti-FLAG抗体对表达的BK_(Ca)蛋白质进行纯化。用western blot检测BK_(Ca)通道蛋白质的表达,用单通道膜片钳检测通道的电生理特性。结果:BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后表达了高水平的BK_(Ca)-FLAG融合蛋白,BK_(Ca)通道电导值为213.39±9.52pS(n=15,cell-attached)和225.72±10.61pS(n=13,inside-out),BK_(Ca)通道具有典型的大电导特性、电压依赖性、Ca2+依赖性及IbTX敏感性,与在体的人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)通道具有相同的特征。纯化后的BK_(Ca)蛋白质条带单一,纯度约为89%。结论:成功构建BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系并获得纯化的BK_(Ca)蛋白质,为进一步深入研究通道功能及药物筛选奠定了重要的基础。
- 毛亮程俊黄文俊谭晓秋党喜同曾晓荣杨艳
- 关键词：膜片钳
- Flag和GFP双标记的BK_(Ca)通道α亚基表达质粒的构建、鉴定和序列分析被引量：1
- 2016年
- 目的:采用重叠PCR法构建表达质粒,为下一步研究通道功能奠定基础。方法:在已有编码大电导钙激活钾通道(BKCa)通道α亚单位的表达质粒pcDNA3.1-h Slo的基础上,采用重叠PCR法构建Flag和GFP双标签标记的表达质粒pcDNA3.1-Flag-hSlo-GFP(Flag-hSlo-GFP)。结果:构建的表达质粒Flag标签插入BKCa通道的S1-S2胞外环,GFP标签连接BKCa通道的胞内C末端,测序结果证实质粒构建成功。结论:成功构建BK通道基因表达质粒Flag-hSlo-GFP,重叠PCR能够很好的用于长片段基因扩增和插入片段的实验。
- 李涛程秀丽黄文俊闫莉曹济民谭晓秋
- 关键词：大电导钙激活钾通道重叠PCR
- Flag和GFP双标记的SK2通道表达质粒的构建、鉴定和序列分析
- 2016年
- 目的:采用Overlapping PCR(重叠PCR)法进行人源SK2通道Flag和GFP融合表达质粒的构建,为下一步胞外运用Flag抗体进行SK2通道的转运调控研究奠定基础。方法:在既往克隆的人SK2通道基因的表达质粒p IRES-SK2的基础上,采用重叠PCR法构建Flag和GFP双标签标记的表达质粒pEGFP-N3-Flag-SK2(简写为Flag-SK2-GFP)。结果:构建的表达质粒Flag标签插入SK2通道的S1-S2胞外环区域,GFP标签连接SK2通道胞内的C末端,通过酶切、测序等证实质粒构建成功。结论:成功构建人心房肌SK2通道基因表达质粒Flag-SK2-GFP,为下一步研究SK2通道转运过程及调控机制奠定了基础。
- 黄文俊李涛范学慧余奕言杨艳曾晓荣谭晓秋
- 关键词：小电导钙激活钾通道重叠PCR
