严翔翔
- 作品数：3 被引量：18H指数：3
- 供职机构：武汉工业学院生物与制药工程学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 米根霉脂肪酶基因的克隆、密码子优化及在毕赤酵母中的分泌表达
- 米根霉脂肪酶具有高度的1、3位置专一性和立体选择性,在芳香酯、生物柴油、手性化合物等有机化合物的合成中具有很高的应用价值。利用基因工程技术实现米根霉脂肪酶的异源高效表达,对该酶的工业化生产具有重要意义。本文以米根霉菌株C...
- 严翔翔
- 关键词：密码子优化
- 文献传递
- 米根霉脂肪酶基因pro-ROL和m-ROL在毕赤酵母中的密码子优化、表达和酶学性质的比较分析(英文)被引量：7
- 2011年
- 米根霉Rhizopus oryzae脂肪酶不仅在众多工业领域中具有良好的应用价值,其典型的分子内伴侣结构(Intramolecular chaperon)也是研究蛋白质翻译后加工和成熟的理想材料。以R.oryzae HU3005为材料,克隆了其脂肪酶前体基因(pro-ROL)和成熟脂肪酶基因(m-ROL),并实现了其在巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115中的分泌表达。酶学性质比较分析表明:m-ROL对中等链长底物(C10和C12)具有更高的水解活性,而pro-ROL更倾向于短链底物(C4),且在pH 8.0时活性最高。再者,pro-ROL具有比m-ROL更好的温度稳定性。推测m-ROL和pro-ROL脂肪酶酶学性质的差异可能是由前序列对脂肪酶的折叠和修饰的影响而导致。为提高m-ROL的表达水平,采用重叠延伸PCR技术将基因中8个低频密码子替换为高频密码子。在摇瓶条件下,发酵72 h后,经密码子优化后的m-ROL酶活和蛋白质含量分别达到132.7 U/mL和50.4 U/mL,而初始m-ROL和pro-ROL酶活和蛋白质含量分别仅为28.7 U/mL和14.4 mg/L、29.6 U/mL和14.1 mg/L。
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- 关键词：重叠延伸PCR毕赤酵母
- 二步法黑曲霉脂肪酶基因lipA的全基因合成及其在毕赤酵母中的高效表达被引量：8
- 2009年
- 黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药等领域具有广泛的用途。获得黑曲霉脂肪酶高效表达的基因工程菌是该脂肪酶规模化应用的前提。通过全基因合成对目的基因进行分子改造和人工组建是实现基因高效表达和体外分子进化的有效手段。本研究主要针对一步法长片段基因合成中复杂结构的非特异性配对和过多的PCR引入碱基错配等问题,采用二步法(组装PCR和酶切-酶连)合成了黑曲霉脂肪酶基因lipA。首先在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对lipA基因密码子及RNA二级结构进行优化并引入ClaI(237位)和PstI(475位)酶切位点;通过组装PCR分别合成lipA基因的各片段F1(237bp)、F2(238bp)和F3(422bp);通过该基因内的ClaI和PstI限制性酶切位点连接成完整的全长lipA基因。本方法有效地降低了长片段合成过程中寡核苷酸片段的非特异性配对、复杂的二级结构以及碱基突变对DNA合成的影响,提高了长片段合成的成功率。经密码子优化后的脂肪酶基因(lipA-syn)在毕赤酵母GS115中经诱导表达72h后,发酵液酶活达176.0U/mL,蛋白质含量为143.7mg/L,较出发基因分别提高了10.8倍和5.6倍。实现了该基因的高效表达,并为产酶参数的优化和酶的规模化制备奠定了基础。
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- 关键词：毕赤酵母
