佟敬山
- 作品数：15 被引量：19H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院军事兽医研究所更多>>
- 发文基金：吉林省应用基础研究项目国家高技术研究发展计划吉林省科技厅资助项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达被引量：2
- 2008年
- 目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
- 佟敬山李昌金宁一于源华刘玉生于芳胡宁宁李霄张钰
- 关键词：人免疫缺陷病毒GP41单链抗体原核表达稳定性
- 抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析被引量：4
- 2007年
- 目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。BglⅡ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。
- 李昌金宁一王宏伟刘玉生于芳佟敬山胡宁宁
- 关键词：外膜蛋白单链抗体
- 西尼罗河病毒的研究进展
- 近年来,随着人类和自然界接触的越来越频繁,使得人兽共患的疾病有增长的趋势,西尼罗河病毒病就是近年来出现的一个典型的疾病,时至今日,他已经导致多人感染甚至死亡。本文就此病毒的一些生物学特性作一简要综述。
- 胡宁宁金宁一李昌刘玉生佟敬山
- 关键词：西尼罗河病毒脑膜脑炎
- 文献传递
- 基于SFVRNA复制子核酸疫苗pIRSFV-HN的构建及其体内外抑瘤作用被引量：4
- 2008年
- 目的:构建基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN,并探讨其体内外的抑瘤作用。方法:基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因构建核酸疫苗pIRSFV-HN,pIRSFV-HN转染人结肠癌细胞HCT-116,以Western blotting检测转染后HCT-116细胞HN的表达水平,以AO/EB双荧光染色检测肿瘤细胞的凋亡,以MTT法检测疫苗对HCT-116细胞增殖的抑制。构建C57BL/6小鼠右后肢皮下荷H22腹水瘤细胞模型,瘤体内注射pIRSFV-HN(共3次),检测该小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平和特异性CTL活性。结果:成功构建基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN。结肠癌细胞HCT-116被疫苗转染后可有效表达HN蛋白,对照细胞则无表达;转染后HCT-116细胞出现凋亡的征象;该细胞的增殖受到明显抑制,最大抑制率达55.34%。移植瘤体内注射疫苗后,荷瘤小鼠血清IL-2、IFN-γ水平显著升高(P<0.05),其CTL活性也显著升高(P<0.01)。结论:基于SFVRNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN在体外可有效地抑制肿瘤细胞;在体内可促使免疫趋向Th1优势,提高其抑瘤免疫水平。
- 张钰金宁一李霄朱继红陈漉刘立明李昌佟敬山李群陈勇志
- 关键词：新城疫病毒核酸疫苗抑瘤作用细胞毒性T淋巴细胞
- 单链抗体标联SEA的抗HIV基因工程靶向药物构建与活性研究
- 如何根除 HIV 感染者或 AIDS 患者体内的病毒细胞储存池,是当前限制 AIDS 治疗的最大瓶颈问题。本研究立足于靶向杀伤 HIV 感染细胞的目的,通过合成可作为导向的抗 HIV-1gp120(gp41)单链抗体基因...
- 李昌金宁一金洪涛王宏刘玉生于芳佟敬山胡宁宁
- 文献传递
- 抗HIV-1白喉免疫毒素的构建及原核表达
- 2007年
- 目的:构建重组DTA-hS120融合基因表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。方法:通过PCR扩增,获得只含白喉毒素(DT)活性部位(DTA)的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:酶切及DNA序列测定鉴定质粒构建正确;SDS-PAGE和Western印迹分析证实,可表达出相对分子质量为54000的融合蛋白,与DTA-hS120融合蛋白的分子量一致;经凝胶成像分析,其表达量约占菌体总蛋白的23%,表达形式主要为包涵体。结论:构建了DTA-hS120重组表达质粒,并获得了高效表达,为进一步研究抗HIV-1治疗药物奠定了基础。
- 于芳金宁一李昌刘玉生佟敬山金洪涛
- 关键词：白喉毒素基因克隆免疫毒素原核表达
- 抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达被引量：4
- 2007年
- 目的构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定。结果酶切及DNA序列测定鉴定正确。SDS-PAGE和West-ern Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75200的蛋白,与DT-hs120融合基因分子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体。结论成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达。
- 于芳金宁一李昌刘玉生佟敬山胡宁宁金洪涛
- 关键词：HIV-1单链抗体
- 抗AIDS新型导向毒素CVN-LP1融合基因的构建及原核表达被引量：1
- 2007年
- 目的:构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法:将已经构建好的pET-CVN和pET-LP1重组质粒,EcoRI和HindⅢ同时进行双酶切,保留LP1片段前端的linker序列。将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1融合表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot鉴定表达产物。结果:重组载体pET-28a(+)-CVN-LP1经PCR及XhoI/EcoRI和EcoRI/HindIII双酶切鉴定,证实构建成功。将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量约为20kDa,与理论大小一致。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的49.58%。SDS-PAGE、Western-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。结论:构建了pET-CVN-LP1原核表达载体,并得到了目的融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。
- 李昌金宁一刘玉生于芳金洪涛李臻佟敬山胡宁宁
- 关键词：核糖体失活蛋白
- RNA干扰技术的研究进展
- RNA干扰(RNAi)是一种在进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,是一种序列特异性的转录后基因沉默(PTGS)。RNA干扰(RNAi)广泛存在于真菌、植物和动物中。RNA干扰技术是近年来迅速发展起来的高效、特...
- 佟敬山金宁一李昌胡宁宁李霄张钰李群
- 关键词：RNA干扰RNAI技术
- 文献传递
- 新型抗病毒蛋白2CVN融合基因的构建、表达与纯化被引量：1
- 2007年
- 目的构建新型抗病毒蛋白2CVN融合基因,增强CVN对病毒的结合性及中和活性,为进一步研究抗病毒药物奠定基础。方法采用PCR法,以pBluescriptⅡSK(+)-CVN质粒为模板,扩增CVN片段,在引物中引入Linker序列,将扩增的CVN片段与载体pET-CVN连接,构建pET-2CVN原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达及产物纯化。结果表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,相对分子质量为29000,与理论预期值完全相符。凝胶成像分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的31.48%,纯化后的目的蛋白纯度达95%以上。结论已成功构建了2CVN融合基因,并获得高效表达。
- 刘玉生金宁一李昌于芳佟敬山胡宁宁金洪涛李臻
- 关键词：抗病毒蛋白融合基因原核表达
