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利用CRISPR/Cas9对基因组中高度同源DNA片段编辑多样性的遗传学研究被引量：4: 2017年; 在基因组中,编码区存在许多高度相似的基因簇或基因群(多拷贝基因),非编码区也存在大量的重复序列。这些重复序列能通过改变染色体的三维结构调控基因的转录,对于生物体的遗传与进化起到了重要的作用。其高度同源的特征使得利用CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑时面临更加复杂的状况。如果编辑的片段是二倍体或多倍体,还会产生各条染色单体上的编辑情况不相同的现象。为此本文选择了2个位于同一染色体相距11 kb的高度同源300 bp片段(L1和L2)进行CRISPR介导的DNA片段编辑。采用一对sgRNA(分别共同靶向两片段的上、下游位点)引导Cas9对HepG2细胞两个高度相似的DNA片段进行切割。片段编辑的细胞进一步单克隆化后,对获得的22个L1/L2编辑的CRISPR单克隆细胞株进行详细的基因型鉴定。结果发现除了这两个DNA片段本身被删除外,它们之间的大片段也存在被删除的现象,三个片段的各种反转组合也很频繁。该研究结果对于采用CRISPR/Cas9系统编辑多拷贝基因或重复序列,尤其是对二倍体或多倍体生物进行基因组编辑时具有重要的借鉴和参考价值。; 汪乐洋黄海燕吴强; 关键词：单克隆

采用DNA片段编辑技术反转CTCF结合位点改变基因组拓扑结构和增强子与启动子功能被引量：5: 2015年; 人类的祖先很早就观察到生物性状的遗传现象，但是直到19世纪60年代孟德尔发现遗传因子的分〈br〉离定律和自由组合定律，遗传学才真正建立并快速发展起来。尽管人类很快有了基因的概念，并认识了核酸和蛋白质，但直到1953年沃森和克里克阐明了DNA的双螺旋结构之后，人类对基因才有了本质的认识，从而开启了分子遗传学时代。随着人类基因组计划测序工作的完成以及最近大规模测序技术的突破，越来越多的研究发现很多遗传疾病相关位点不仅位于启动子和基因编码区，而且也大量地存在于调控组织发育基因表达的增强子中。更多的遗传疾病相关位点则位于功能未知的基因组区域。近年研究发现这些遗传疾病相关位点可能与三维基因组（3D genome）息息相关并通过染色体高级拓扑架构（Higher-order topological chromosome architec-ture）起作用。; 郭亚吴强; 关键词：启动子功能 DNA片段拓扑结构增强子结合位点 CTCF

人类原钙粘蛋白基因簇调控元件的克隆及对其启动子活性的影响被引量：3: 2014年; 人类原钙粘蛋白(Protocadherin,Pcdh)基因簇包含53个成串排列非常相似的基因,组成3个紧密相连的基因簇(α,β和γ)。原钙粘蛋白基因簇γ通过启动子选择性表达产生神经元细胞膜表面的分子多样性,但是,该多样性产生的分子机制还不清楚。调控元件HS7L和HS5-1aL作为候选的增强子可能具有调控Pcdhγ基因表达的作用。利用分子克隆的方法,将调控元件HS7L和HS5-1aL分别克隆至包含γa9、γa10、γb3、γb7和γc3启动子的荧光素酶报告基因的下游。通过荧光素酶报告基因试验检测其对该5种Pcdhγ启动子活性的影响,发现HS7L对5种启动子活性具有增强作用,HS5-1aL对γa10启动子活性具有增强作用。之后,通过基因沉默绝缘子CTCF,发现下调CTCF不仅降低γb1基因表达,而且能够显著降低γb1启动子报告基因活性。试验结果表明调控元件HS7L和HS5-1aL能够增强Pcdhγ启动子活性,推测可能通过CTCF介导的增强子-启动子相互作用调控Pcdhγ的细胞特异性基因表达。; 吴海洋郭亚李伟吴强

小鼠原钙黏蛋白的多样性分析及其亚型的克隆与表达: 2014年; 原钙黏蛋白(protocadherin)是广泛分布于中枢神经系统的一类跨膜蛋白,是钙黏蛋白家族中最大的亚族。成簇Pcdh基因包含3个串联的基因簇——Pcdhα、β、γ,其中Pcdhα和γ分别由14个和22个可变区及各自共同的恒定区组成。这种特殊蛋白结构决定了原钙黏蛋白各亚型在功能上既相似又不完全相同,为了系统研究原钙黏蛋白各个亚型的功能,本研究对原钙黏蛋白家族氨基酸序列保守性进行了系统性分析,并据此设计特异性的引物来完成原钙黏蛋白各个亚型的克隆;并以原钙黏蛋白α1基因为例,通过PCR方法成功将其从小鼠大脑中克隆并构建到带有Myc标签的真核表达载体pc DNA3.1上;利用脂质体转染方法将该基因成功表达于293T细胞。本研究结果将为后续其他亚型的克隆建立技术平台。; 王武明索伦周雨潇鲁琳吴强; 关键词：基因克隆小鼠氨基酸序列

基因组编辑技术研究前沿与挑战被引量：3: 2015年; 人类对自然界生物的改造包括许多方面：通过动植物的育种尽可能获得高质、高产的农副产品来满足人类日益增长的物质生活需要；对抗生素、抗体、疫苗等生产菌株的基因组进行改造，为人类提供高质量的诊断和治疗用医药产品；通过合适的工具去定点修复人类自身的基因从而达到治疗疾病的目的可以说是“人定胜天”的终极目标。所有这些操作都涉及到基因组的改造或编辑。基因组编辑技术的研发为人类改造自然界生物（本文所指的自然界包括地球上所有的野生和改造的动植物、微生物及人类本身）提供了新的工具，使“传统的不能”变为“可能”。; 谷峰高彩霞吴强张博; 关键词：基因组自然界微生物农副产品生产菌株医药产品

CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用被引量：16: 2015年; 源于细菌和古菌的Ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9(Cas9),CRISPR/Cas9]近年被改造成为基因组定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、费用低廉等巨大优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。本文重点介绍了CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段靶向编辑方面的研究和应用,主要包括DNA片段的删除、反转、重复、插入和易位,这一有效的DNA片段编辑方法为研究基因功能、调控元件、组织发育和疾病发生发展提供了有力手段。本文最后展望了Ⅱ型CRISPR/Cas9系统的应用前景和其他类型CRISPR系统的应用潜力,为开展利用基因组DNA片段靶向编辑进行基因调控和功能研究提供参考。; 李金环寿佳吴强; 关键词：基因功能调控元件疾病发生

原钙粘蛋白基因簇调控区域中成簇的CTCF结合位点分析被引量：15: 2016年; 哺乳动物中原钙粘蛋白(Protocadherin,Pcdh)基因簇包含50多个串联排列的基因,这些基因形成3个紧密相连的基因簇(Pcdh?、Pcdh?和Pcdh?),所编码的原钙粘蛋白质群在神经元多样性(Neuronal diversity)和单细胞特异性(Single cell identity)以及神经突触信号转导中发挥重要作用。前期的工作已证实转录因子CTCF(CCCTC-binding factor)与CTCF结合位点(CTCF-binding site,CBS)的方向性结合能够决定增强子和启动子环化的方向以及其远距离交互作用的特异性,并进一步在Pcdh基因座(Locus)形成两个(Pcdh?和Pcdh?)染色质拓扑结构域(CTCF/cohesin-mediated chromatin domain,CCD),而且染色质拓扑结构域对于控制基因表达调控至关重要。本文通过生物信息学方法对比人类和小鼠序列,发现Pcdh??染色质拓扑结构域调控区域中的DNase I超敏位点(DNase I hypersensitive sites,HSs)较为保守。染色质免疫沉淀及大规模测序实验(Chromatin immunoprecipitation and massive parallel sequencing,Ch IP-Seq)揭示CBS位点在Pcdh??调控区域中成簇分布并且具有相同的方向。凝胶电泳迁移实验(Electrophoresis mobility shift assay,EMSA)确定Pcdh??调控区域内具体的42 bp CBS位点并且发现一个CTCF峰包含两个CBS位点。在全基因组范围内,运用计算生物学方法分析CTCF和增强子、启动子等调控元件的关系,发现CBS位点在调控元件附近有较多分布,推测CTCF通过介导增强子和启动子的特异性交互作用,在细胞核三维基因组内形成活性转录枢纽调控基因精准表达。; 翟亚男许泉郭亚吴强

过表达LXRα和RXRA对HepG2全基因组转录的影响被引量：1: 2020年; LXRα(Liver Xreceptorα)是一种氧甾醇核受体在免疫和脂类代谢等生物过程中发挥重要作用,为了进一步探究LXRα的生物学功能,本研究对LXRα和RXRA共同过表达的HepG2细胞进行了全基因组转录分析。在HepG2细胞中LXRα和RXRA共同过表达导致451个基因发生差异表达(p<0.05)其中有213个基因表达上调,221个基因表达下调,通过GO(Gene ontology)功能和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomics)通路基因富集分析发现这些基因参与调控化合物代谢、转录和免疫防御等生物过程。此外还发现在HepG2细胞中,LXRα和RXRA过表达也导致细胞死亡和凋亡相关基因的部分沉默或激活,证明LXRα也参与调控细胞死亡和凋亡。本研究首次在HepG2细胞中通过同时过表达LXRα和RXRA分析LXRα的靶基因及其所参与的生物过程和信号通路,为后续LXRα的功能发掘和相关疾病的药物开发和治疗提供了理论依据。; 肖龙会黄海燕吴强; 关键词：LXRΑ HEPG2 RNA-SEQ

PCDHα在髓鞘形成和少突胶质细胞发育中的作用被引量：4: 2012年; 该文通过免疫组化及蛋白免疫印迹的方法分别对Pcdhα基因敲除和对照组小鼠的中枢神经系统内的髓鞘碱性蛋白表达以及少突胶质细胞的发育进行了测定。结果表明:1)Pcdhα基因缺失小鼠中枢神经系统中的髓鞘碱性蛋白较对照组小鼠明显减少;2)Pcdhα基因敲除可导致少突胶质细胞发育异常:在小脑中,处于成熟期的少突胶质细胞减少,而处于前体细胞阶段的少突胶质细胞增多。上述结果提示Pcdhα可以通过调控少突胶质细胞的成熟过程进而影响髓鞘的形成。; 于钰索伦吴强; 关键词：髓鞘少突胶质细胞发育

原钙粘蛋白分子与神经元的多样性被引量：3: 2013年; 大脑是人体内结构和功能最为复杂的器官,它实现人类的感知、情感、思维、记忆并控制其他器官的活动。神经元是大脑结构的基本单元,大约1000亿个神经元通过神经突起相互连接组成复杂而有序的神经网络。神经元是多种多样的,神经元的多样性决定了大脑处理储存信息的容量。科学家们发现神经元的多样性与一种膜蛋白分子-原钙粘蛋白的分子多样性有关,不同原钙粘蛋白分子在神经元内随机组合表达赋予每个神经元自己的个性。; 李伟吴强; 关键词：大脑神经元神经网络

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