于峰
- 作品数：15 被引量：28H指数：3
- 供职机构：江苏大学生命科学研究院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 能产生多角体的可线性化杆状病毒的构建被引量：2
- 2008年
- 【目的】改进用于同源重组研究的制备杆状病毒DNA的方法。【方法】采用PCR方法从BmNPV中扩增出多角体基因,并在其两端引入Bsu36I酶切位点。将此片段克隆入转移载体pBacPAK8中,与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞,获得重组病毒。该病毒能形成多角体,便于纯化,同时可以被Bsu36I酶切。该重组病毒的多角体纯化后被裂解,并提取病毒DNA。病毒DNA经Bsu36I酶切后,与含gfp基因的转移质粒共转染家蚕BmN细胞,在荧光显微镜下观察重组病毒的转染效率。【结果】BmNPV多角体基因克隆入转移载体pBacPAK8中后,与线性化的AcPak6及BmPak6DNA共转染sf细胞及BmN细胞,均能产生大量的多角体。获得的重组病毒DNA经酶切后,进一步与含gfp基因的转移质粒共转染的实验表明,这种改造后的重组病毒仍具有较高的转染重组率。【结论】本实验成功地对用于同源重组的杆状病毒DNA进行了改进,简化了病毒DNA的纯化方法,并且重组效率较高。
- 于峰朱姗颖李兵沈卫德王文兵
- 关键词：BMNPVDNA提取
- 肺癌转移相关基因的差减文库的构建
- 2005年
- 目的发现与肺癌转移相关的基因。方法选择4例转移和5例非转移患者肺癌的RNA混合样品进行差减杂交。经过两步骤的杂交后,构建了转移相关基因的差减文库。对获得阳性克隆进行测序和同源性分析。结果一共获得了225个阳性克隆。在GenBank中序列比对的结果表明,它们分属124个基因。其中25个基因出现的频率大于一次,并有9个序列未找到同源基因。结论该结果将有助于各类肿瘤转移相关基因的研究。
- 王文兵宋志秀于峰
- 关键词：肺肿瘤肿瘤转移核酸杂交基因文库
- GP64表面展示元件与组Ⅱ HaSNPV出芽病毒的融合被引量：1
- 2012年
- 利用杆状病毒组ⅠAcMNPV(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)GP64信号肽(GP64SP),C-末端跨膜区(GP64CTD)及报告基因绿色荧光蛋白(eGFP)构成的表面展示系统(gp64sp-egfp-gp64ctd),同源重组到组ⅡHaSNPV的多角体基因位置,筛选重组病毒。通过激光共聚焦观察,HaSNPV重组病毒感染Hz-AM1细胞后绿色荧光分布在质膜,表明GP64SP可以引导表达产物趋向于细胞膜。病毒感染后,收集并纯化重组的出芽病毒(BV),经Western blot检测,eGFP存在于重组病毒BV中。结果表明,组ⅠGP64表面展示系统中的重要元件GP64SP和GP64CTD能够装配到组ⅡHaSNPV BV上,可以用于组ⅡNPV表面展示目的蛋白。
- 刘永于峰曹青徐琳琳陈修文王文兵
- 关键词：GP64HASNPV
- 山羊痘病毒p32基因的原核表达及生物信息分析被引量：1
- 2012年
- 目的:构建表达山羊痘(GPV)P32蛋白的原核表达载体PTYB11-gpvp32,初步分析其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的较佳表达条件。方法:首先用序列分析软件Blastp、MEGA5.1、SOSUI等对GPVP32进行生物信息学分析;Primer Primier5.0软件设计引物,在上游引物添加限制性酶切位点SpeⅠ、下游引物添加限制性酶切位点XhoⅠ,以pSK-gpvp32为模板,PCR扩增方法获得基因片段,克隆入PMD18-Simple-T,构建PMD18SimpleT-gpvp32载体,转化大肠杆菌(E.coli)Top10感受态细胞,经酶切筛选、测序确定插入序列的正确,然后将gpvp32克隆入原核表达载体PTYB11中的SpeⅠ、XhoⅠ酶切位点,构建原核表达质粒PTYB11-gpvp32;转化大肠杆菌(E.coli)BL21后,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白在不同诱导时间下的表达情况。结果:成功构建山羊痘病毒原核表达载体PTYB11-gpvp32并在大肠杆菌(E.coli)BL21中成功表达GPVP32,经检测重组蛋白表达量约为菌体总蛋白的28%,进化树结果表明山羊痘的亲缘关系与地理位置存在差异及在不同的羊群中进化的结果,经SOSUI等软件综合分析知GPVP32是山羊痘病毒跨膜蛋白的囊膜蛋白但不是信号肽。结论:山羊痘病毒p32基因在大肠杆菌中获得高效表达,为山羊痘病毒的流行性调查、分子生物学研究以及以后有效防治本病提供了物质基础。
- 蒲德治龚晨燕刘永蒋高建于峰
- 关键词：山羊痘病毒P32基因原核表达
- 双特异性单链抗体BiTE的研究进展被引量：2
- 2018年
- 癌症是严重威胁人类生存的重大疾病。BiTE(bispecific T-cell engager)所代表的一类具有显著抗肿瘤效应的双特异抗体,能够靶向性激活自身T细胞杀伤肿瘤细胞。BiTE由两个单链可变片段(scFv)组成,通过柔性融合接头串联连接。一个scFv识别T细胞表面蛋白CD3ε,而另一个scFv识别特异性肿瘤细胞表面抗原。BiTE的这种结构和特异性结合蛋白能力允许它将T细胞物理性地桥接肿瘤细胞而形成T细胞-BiTE-肿瘤细胞复合物,诱导免疫突触形成,刺激T细胞活化,产生杀伤肿瘤的细胞因子。近年来,BiTE在抗肿瘤研究中取得了显著进展,在临床上取得了理想的治疗效果。因此,对BiTE的结构、作用机制、临床应用以及创新性运用进行阐述。
- 周冲于峰韩邦兴周阳刘黎琼施海峰
- 关键词：双特异性单链抗体BITE免疫治疗
- 人CD46基因启动子的克隆和启动特性研究被引量：4
- 2012年
- 为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%。用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI。重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子。
- 李国才刘双喜于峰杜庆辉王劲松潘兴元季明春焦红梅
- 关键词：EGFP启动特性淋球菌
- 携带抗FAP×抗CD3双特异性抗体重组溶瘤痘病毒的构建及其抗癌活性观察
- 2019年
- 目的:构建携带抗成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)和抗小鼠CD3分子的双特异性抗体溶瘤痘病毒(r VVDD-BiTE. FAP),并体外检测该病毒对过表达FAP小鼠肺癌细胞株抑制作用。方法:利用同源重组技术将PF17R启动子调控的Bi TE-FAP基因和PSEL启动子调控的DsRed基因克隆入缺失痘苗生长因子(vaccinia growth factor,VGF)基因的v SC20亲本病毒TK基因处,经软琼脂空斑筛选获得VGF和TK双基因缺失的重组溶瘤痘病毒r VVDD-BiTE. FAP。采用空斑计数法比较重组溶瘤病毒和亲本病毒v SC20在小鼠肺癌细胞株中的复制能力;采用MTS法检测重组溶瘤病毒r VVDD-BiTE. FAP和r VVDD-GFP对小鼠肺癌LLC细胞株的抑制效果,并用MTS、LDH实验进一步检测溶瘤病毒和小鼠脾脏T细胞对靶细胞的协同杀伤效果,采用ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的表达。结果:通过同源重组技术和软琼脂空斑法筛选获得r VVDD-BiTE. FAP重组溶瘤痘病毒。r VVDD-BiTE. FAP与亲本病毒具有同等复制能力;小鼠T细胞能够增强r VVDD-BiTE. FAP抗肿瘤效果。结论:r VVDD-BiTE. FAP具有高效抗肿瘤活性。
- 施晋升李峰吴思慧俞力超刘黎琼于峰
- 关键词：双特异性抗体成纤维细胞活化蛋白靶向免疫治疗
- RAD51AP1沉默通过调控有丝分裂基因抑制肝癌细胞增殖被引量：1
- 2022年
- 目的分析沉默RAD51AP1基因对肝癌细胞增殖的影响,并初步探索其作用机制。方法利用qPCR检测RAD51AP1在不同肝癌细胞系中的表达;制备shRAD51AP1慢病毒并转导HepG2和Huh7细胞来沉默RAD51AP1,采用qPCR检测RAD51AP1的沉默效率;MTS法和克隆形成实验检测RAD51AP1沉默对细胞增殖和克隆形成能力的影响;根据转录组测序结果筛选出差异表达基因,并作进一步的检测分析;通过裸鼠体内成瘤实验研究RAD51AP1沉默对肝癌细胞增殖的影响。结果MTS结果显示,HepG2和Huh7细胞中RAD51AP1沉默组的增殖能力均显著低于对照组(P<0.01);克隆形成实验显示,RAD51AP1沉默组克隆形成数明显少于对照组(P<0.01);通过转录测序筛选出差异表达基因TACC1、NEK7,并从蛋白水平进行了验证。结论RAD51AP1基因沉默能够有效抑制肝癌细胞增殖,有望成为预防或治疗肝癌的新靶点。
- 孙敏刘国栋朱孝中徐俊于峰徐庆刚
- 关键词：增殖肿瘤形成
- 分子生物技术检测桑花叶型萎缩病原被引量：7
- 2007年
- 根据多年对桑花叶型萎缩病的追踪研究,分离获得了病桑组织类似类病毒的小分子RNA,对其部分序列进行解析,并以之作为病原物的分子标志物,用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、点杂交和Northern-blot等分子生物技术方法检测症状明显的病株,取得了比较理想的结果。
- 费建明白锡川于峰赵航王文兵蒯元璋
- 关键词：桑花叶型萎缩病类病毒分子生物学
- 痘苗生长因子和胸苷激酶双基因缺失表达双荧光溶瘤痘病毒的构建及其对胰腺癌细胞的杀伤作用被引量：2
- 2016年
- 目的:构建痘苗生长因子(vaccinia growth factor,VGF)和胸苷激酶(thymidine kinase,TK)双基因缺失同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和DsRed双荧光的溶瘤痘病毒,并研究其对胰腺癌细胞的杀伤作用。方法:在病毒TK基因处利用同源重组方法将病毒晚期启动子F17R调控的GFP基因和早晚期启动子SEL调控的DsRed基因克隆入缺失VGF基因的VSC20亲本病毒,构建同时缺失VGF和TK双基因的重组溶瘤痘病毒vv DD-GFP-DsRed。同时利用CCK-8法和结晶紫染色法检测该病毒对胰腺癌细胞Patu8988和Bx PC-3的杀伤作用。结果:通过同源重组和软琼脂筛选获得vv DD-GFP-DsRed重组溶瘤痘病毒。CCK-8法结果显示,与MOI=0相比,MOI分别为1,10时,vv DD-GFP-DsRed对Patu8988细胞和Bx PC-3细胞具有明显的杀伤作用,且在此范围内随MOI值增加杀伤效果逐渐增强(P均<0.05)。与MOI=0相比,Patu8988细胞在MOI为0.01时存活率低(P<0.05),且在结晶紫染色法测定中形成了明显的空斑。结论:成功构建vv DD-GFP-DsRed重组溶瘤痘病毒,其对胰腺癌细胞具有明显的杀伤作用。
- 徐岷夏瑜周冲刘黎琼周改施海峰于峰张尤历
- 关键词：胰腺癌
