- 金黄金葡萄球菌EAP研究进展被引量：2
- 2009年
- 金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物疾病的常见的革兰阳性菌，它具有很高的致病率和病死率。轻微的伤口感染可发展为恶性的脓毒症、骨髓炎、脓毒性关节炎或是心内膜炎，是医院感染中最常见的病原菌之一。甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（methicillin—resistant S．aureus，MRSA）菌株，可抵抗大多数临床上应用的抗生素。令人忧虑的是，MRSA菌株对治疗葡萄球菌感染最为有效的抗生素——万古霉素的敏感性日益降低，因此必须寻找到一种有效的治疗方法。
- 卢杰卢珍李昶苏莉芬吕茂利王维双
- 关键词：EAPMRSA菌株甲氧西林耐药AUREUS葡萄球菌感染革兰阳性菌
- 金黄色葡萄球菌eap基因的克隆与表达
- 2008年
- 目的构建携带eap基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组EAP融合蛋白。方法PCR法扩增金黄色葡萄球菌基因组DNA,回收、纯化的扩增产物与pMD18-T载体相连接得重组质粒pMD18-T-EAP,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;未酶切组作为对照组重组质粒pMD18-T-EAP和pET28a(+)表达载体分别用NdeI和XhoI限制性内切酶双酶切、连接,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;空载体作为对照组。用不同浓度(终浓度1、2、4、8mmol/L)和不同诱导时间(1、2、3、4、5、6h)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性重组菌进行表达优化,分别取E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用MagneHis-蛋白纯化系统纯化重组EAP融合蛋白,并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。结果所获eap基因与GeneBank的基因序列同源性>99%;氨基酸同源性达100%。重组质粒经IPTG诱导,阳性重组菌转化子均有表达;当吸光度(A)值等于0.6～0.8时,相对分子质量约70000处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚,沉淀中几乎看不到。终浓度1mmol/L为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG诱导1h重组EAP融合蛋白有一定量的表达,随着时间的延长,表达量增加不明显,3h时的表达量达最高,之后,蛋白表达量变化不明显。表达的重组EAP融合蛋白含量占全菌体蛋白的29.6%。结论成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组EAP融合蛋白,为进一步研究以EAP蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。
- 卢杰卢珍
- 关键词：葡萄球菌金黄色克隆基因
- 肺炎链球菌重组PrtA蛋白克隆与表达的相关研究
- 2012年
- 目的构建携带PrtA基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组PrtA融合蛋白。方法根据GenBank中肺炎链球菌表面蛋白细胞壁相关丝氨酸蛋白酶A(PrtA)蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增目的片段,建立了RT-PCR检测方法。应用RT-RCR方法扩增得到PrtA蛋白基因,并克隆到pMD18-T载体上,筛选、鉴定阳性重组子pMD18-T-PrtA,然后克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,经双酶切、PCR鉴定,获得重组表达质粒pET-30a-PrtA。将含有pET-30a-PrtA的重组菌,经终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导后,重组PrtA蛋白获得高效表达。通过Westernblot检测结果,检测表达的重组PrtA蛋白的反应原性。结果所获PrtA基因与GenBank的基因序列同源性为99%;重组质粒经IPTG诱导,不同浓度的IPTG均能诱导重组蛋白表达,且IPTG终浓度为0.6mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的18%。通过抗-His标签单克隆抗体在IPTG诱导6h的重组菌蛋白中检测到一条大小约为40×103的特异性清晰条带,与预期结果相符,表明表达的蛋白为肺炎链球菌重组PrtA蛋白。结论成功地克隆和表达了肺炎链球菌表面蛋白细胞壁PrtA,为进一步研究以PrtA蛋白作为免疫原预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病奠定基础。
- 卢杰王忠伟计红马越李昶姜世君
- 关键词：基因表达
