李耀坤
- 作品数：8 被引量：23H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 胸膜肺炎放线杆菌萘啶酸抗性菌株的选育和信号标签突变株的构建被引量：3
- 2008年
- 胸膜肺炎放线杆菌(APP)是重要的猪呼吸道病原菌,给世界养猪业造成严重的经济损失。信号标签突变(STM)技术是在宿主动物体内鉴定病原菌毒力因子的高通量方法。通过体外传代选育出APP血清1型和3型萘啶酸抗性菌株,再以萘啶酸抗性菌株为受体菌,以携带mini-Tn10的标签质粒(pLOF/TAG1-48)的E.coliCC118λpir或S17-1λpir为供体菌,在或不在E.coliDH5α(pRK2073)的辅助下,进行三亲本或两亲本接合,通过抗性筛选、PCR和Southern杂交鉴定转座突变株。结果表明:体外萘啶酸加压传代很容易选育出萘啶酸抗性APP菌株,该抗性的产生与DNA促旋酶A亚基基因gyrA的突变有关。在APP与E.coli接合实验中,两亲本接合比三亲本接合操作更简单,效率也较高;APP不同菌株在接合和转座效率上存在很大差异,血清1型菌株高于血清3型菌株,3型标准菌株高于地方分离株JL03-R。本研究为APPSTM突变体库的构建与毒力基因的鉴定奠定了基础。
- 商霖李薇李良军黎璐张四化李婷婷李耀坤刘磊郭志伟周锐陈焕春
- 关键词：胸膜肺炎放线杆菌
- 牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定被引量：2
- 2013年
- 【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区(coding sequence,CDS)序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并在293A细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒,GFP标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞,实时荧光定量法(qRT-PCR)检测干扰效率。【结果】筛选出靶向牛SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了pAd-1053和阴性对照pAd-NC重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053和Ad-NC高滴度病毒,测定得到的病毒滴度分别为7×108 GFU·mL-1和9×108 GFU·mL-1。Ad-1053和Ad-NC分别侵染牛前体脂肪细胞,qRT-PCR检测结果显示Ad-1053可显著降低SREBP1基因的mRNA水平(干扰率>85%),而Ad-NC对SREBP1基因表达无明显影响。【结论】成功筛选得到靶向干扰牛SREBP1基因的有效shRNA,并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。
- 付常振昝林森王虹成功王洪宝李耀坤姜碧杰高建斌杨宁
- 关键词：SHRNA重组腺病毒
- 胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建及tadD基因功能的初步研究
- 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎的病原菌,给全球养猪业造成巨大的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。但由于APP血清型众多,而且各...
- 李耀坤
- 关键词：胸膜肺炎放线杆菌猪传染性胸膜肺炎
- 奶牛性控冻精生产工艺改进及效果分析被引量：3
- 2013年
- [目的]为了提高奶牛性控冻精的生产水平。[方法]通过对奶牛性控精液生产过程中染色时间及冷冻精液处理时间的控制,研究其对性控冻精的常规品质及改进后的效果,并对性控冻精的品质及生产成本进行综合评定。[结果]表明:生产工艺改进后,与传统性控冻精制作方法相比,不但提高了精子品质,而且提高了精子分离速度。[结论]这一工艺的改进明显增加了每支细管的有效精子数并显著降低了生产成本。
- 赵宪林李耀坤田万强胡建宏昝林森王韦华
- 关键词：奶牛活率顶体完整率
- 秦川牛DKK1基因SNPs检测及其与体尺、肉质性状的关联分析被引量：6
- 2013年
- 旨在对秦川牛DKK1基因进行SNPs检测,并研究其与秦川牛体尺、肉质性状的相关性。本研究随机选择相近饲养条件下447头18～24月龄的秦川牛母牛,采用DNA直接测序技术并结合PCR-SSCP方法进行DKK1基因全区段遗传变异检测。运用SPSS16.0程序中最小二乘法拟合线性模型对DKK1基因不同基因型与秦川牛体尺(体斜长、体高、腰高、尻长、腰角宽、胸深、胸围和坐骨端宽)和肉质性状(背膘厚、眼肌面积和肌间脂肪含量)进行关联分析。经DNA测序发现秦川牛DKK1基因存在5个突变位点,分别为第一内含子G523A突变;第二内含子A999G和A1 169G突变;第三内含子C1858T突变;第四外显子A2355G突变,其为第247位氨基酸Cys→Arg的错义突变。PCR-SSCP方法检测得到G523A和A2355G位点仅存在2种基因型;A999G、A1169G和C1858T位点存在3种基因型。卡方检验显示,G523A、A1169G和A2355G位点则处于Hardy-Weinberg极度不平衡状态(P<0.01),而A999G和C1858T位点于检测群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。关联分析表明,秦川牛DKK1基因不同突变位点的不同基因型与体斜长、体高、腰高、尻长、坐骨端宽和背膘厚、眼肌面积、肌间脂肪含量差异显著相关(P<0.05或P<0.01)。DKK1基因对秦川牛部分体尺、肉质性状有显著的影响,可以尝试作为秦川肉牛新品系培育的主效候选基因。
- 高建斌昝林森杨宁李耀坤皇甫一凡郝瑞杰马向辉付常振姜碧杰成功
- 关键词：SNPSPCR-SSCP体尺性状肉质性状
- piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定被引量：2
- 2013年
- 【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞。【结果】经过酶切和测序鉴定,载体pPB-AFABP构建正确;PB二元系统的阳性克隆数明显多于转座子载体pPB-AFABP的克隆数;PCR鉴定结果表明,牛成纤维细胞中存在目的基因A-FABP。【结论】成功构建了转基因表达载体pPB-AFABP,且证实PB转座子在牛成纤维细胞中具有较高的转座活性。
- 杨宁昝林森成功付常振李耀坤
- 关键词：PIGGYBAC转座子A-FABP基因
- 胰岛素诱导牛成肌细胞成脂分化的研究被引量：2
- 2014年
- 【目的】建立稳定成熟的牛成肌细胞胰岛素诱导成脂分化体系,为肉牛肉脂品质的改良提供参考。【方法】取1日龄荷斯坦公牛犊后腿肌肉,用Ⅳ型胶原酶消化法分离成肌细胞,用胰岛素诱导成肌细胞成脂分化,以未添加胰岛素的培养基为对照组,检测成肌细胞成脂分化过程中细胞形态的变化,并分析与成肌细胞和脂肪细胞分化相关基因(C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ、Myf5、MyoD)分别诱导第3,6,9,12,15天相对表达量的变化,分析牛成肌细胞的诱导分化情况。【结果】成功分离培养了牛原代成肌细胞。胰岛素处理组细胞中脂滴的油红O染色明显,C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ和MyoD相对表达量明显增高,C/EBPα和Myf5基因相对表达量则下降;用DMEM高糖培养基+体积分数10%胎牛血清(FBS)培养时,C/EBPs基因相对表达量总体高于DMEM高糖培养基+体积分数20%FBS+体积分数10%马血清(HS)。【结论】成功分离并鉴定了牛成肌细胞,建立了适于牛成肌细胞的体外培养体系,用胰岛素诱导成肌细胞成脂分化效果好。
- 皇甫一凡昝林森王洪宝成功刘扬高建斌李耀坤杨宁
- 关键词：成肌细胞成脂分化胰岛素PPARΓ基因
- 秦川牛SREBP1基因重组腺病毒载体的构建与病毒包装被引量：5
- 2013年
- 克隆秦川牛的SREBP1基因并构建重组腺病毒表达载体,包装扩繁获得高滴度病毒,拟为在细胞水平上开展基因功能的研究奠定基础。本试验以秦川牛脂肪组织为试验材料,提取总RNA并反转得到cDNA,以Gen-Bank收录的牛的SREBP1基因mRNA序列设计引物,PCR扩增SREBP1基因与克隆载体pMD19-T Simple连接并测序鉴定。挑选测序正确的SREBP1基因酶切后连接到腺病毒穿梭载体上构建pAdTrack-CMV-SREBP1表达载体,用PmeⅠ限制酶酶切线性化,然后转染到含有骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP1。用PacⅠ限制酶酶切线性化pAd-SREBP1载体并回收质粒大片段,转染293A细胞包装病毒并扩繁提高病毒滴度,绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定腺病毒的滴度。本试验成功克隆了秦川牛的SREBP1基因,测序结果与GenBank收录的牛的基因序列比较有2处位点突变,均已排除扩增酶的保真性不高等外界因素造成的。将SREBP1基因与穿梭载体连接构建了pAdTrack-CMV-SREBP1表达载体,并与骨架载体重组得到重组腺病毒载体pAd-SREBP1,用PacⅠ酶切线性化包装病毒,扩繁得到病毒滴度为1.5×109 GFU·mL-1高滴度病毒。本研究成功克隆秦川牛SREBP1基因并重组成病毒重组子,包装扩繁得到高滴度腺病毒。
- 付常振昝林森王虹姜碧杰成功王洪宝朱光星李耀坤王洪程
- 关键词：腺病毒
