腺病毒具有免疫原性,可被机体快速免疫清除,导致目的基因失去表达,这是其作为基因治疗载体的主要缺陷。一些特定的细胞,如角膜上皮细胞和睾丸Sertoli细胞能表达和分泌Fas配体(FasL),诱导带有Fas分子的免疫细胞发生凋亡。目的:构建FasL和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)共表达PCA_(13)质粒用于腺病毒的包装,以进一步观察FasL对腺病毒载体的免疫保护作用。方法:利用内源性核糖体进驻位点(IRES),通过感受态细胞的制备和转化、质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳以及限制性内切酶等多种基因工程技术,经多步亚克隆后完成能同时表达FasL和iNOS基因的多顺反子腺病毒表达载体PCA_(12)/FasL-IRES-iNOS的构建。结果:新质粒PCA_(13)/FasL-IRES-iNOS经限制性内切酶酶切后得到1600 bp(600 bp FasL,1000 bp IRES)和4000 bp(iNOS)的相应基因片断,基因序列经测定与基因文库报道相符。结论:成功构建了多顺反子腺病毒表达载体PCA_(13)/FasL-IRES-iNOS,为门脉高压症的基因治疗打下了基础。
