罗红伟
- 作品数：19 被引量：29H指数：3
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 泛素连接酶β-TrCP降角翠BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的抑制被引量：3
- 2010年
- 目的:t(9;22)(q34;q11)突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化区域(Oligomerization domain,OD)特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP的β-TrCP-OD-HA的重组腺病毒载体,经泛素-蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的影响。方法:HEK293细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5ΔF-TrCP-OD-HA及空载Ad5GFP重组腺病毒载体,感染K562细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA对K562细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA重组腺病毒载体的K562细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4%以上,β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA可在K562细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S期细胞数下降至10.88%±2.42%、G_0/G_1期升高至85.6%±5.61%,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P均<0.05)。结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA能够在白血病K562细胞中表达;β-TrCp-OD-HA可以抑制K562细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。
- 田文君罗红伟袁颖黄世峰刘钉宾陶昆冯文莉
- CCAAT/增强子结合蛋白α对K562细胞分化和凋亡的影响及其机制被引量：2
- 2009年
- 目的:研究CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein-alpha,C/EBPα)对K562细胞株分化和凋亡的影响及对相关基因的调控,为慢性粒细胞白血病的治疗提供新的治疗靶点。方法:将C/EBPα表达质粒pEGFP-C/EBPα及空载体对照质粒pEGFP分别经阳离子脂质体2000介导转染K562细胞,用G418筛选出C/EBPα稳定表达细胞株。Wright-Giemsa染色观察细胞形态学变化,FCM分析细胞表面分化抗原CD11b的表达、细胞周期及细胞凋亡,电子显微镜观察细胞凋亡,RT-PCR和Western印迹法检测细胞中相关基因Per2、cyclin B1和C-myc的表达。结果:筛选得到稳定表达C/EBPα的细胞株pEGFP-C/EBPα-K562。与空载体转染组及对照组细胞相比,转染组K562细胞分化明显,同时粒系细胞表面分化抗原CD11b表达增加;细胞周期分析发现,转染组细胞中G2期细胞增多,与空载体组和对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),同时出现细胞凋亡峰。细胞凋亡检测结果显示,转染组细胞凋亡明显增加(21.1%),与空载体组(6.0%)和对照组(4.2%)比较,差异有统计学意义(P<0.05);电子显微镜观察发现,转染组细胞中出现染色质浓集、断裂和核固缩等现象,并见凋亡小体;RT-PCR和Western印迹法检测发现,C/EBPα明显上调Per2 mRNA和蛋白表达,抑制cyclinB1、C-myc mRNA和蛋白的表达。结论:C/EBPα能促进K562细胞分化,并诱导细胞凋亡,其机制可能是通过对细胞周期相关基因的调控来实现的。
- 孙成铭黄世峰罗红伟刘钉宾田文君朱喜丹冯文莉黄宗干
- 关键词：CCAAT增强子结合蛋白细胞周期
- HnRNPE2 decoy RNA恢复C/EBPα活性诱导32D-P210的细胞粒系分化
- 2009年
- 目的:采用核不均一核糖核蛋白E2(hnRNP E2)decoy RNA靶向阻断CCAAT增强子结合蛋白alpha(C/EBPα)基因的异常翻译,诱导小鼠白血病样32D-P210细胞株向粒系分化,并进一步探讨其分子机制.方法:电穿孔法分别将野生型和突变型hnRNP E2 decoy RNA表达质粒转染入32D-P210细胞,经G418筛选出稳定株后,RT-PCR检测C/EBPa,粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)与髓过氧化物酶(MPO)基因的mRNA水平;WesternBlot检测C/EBPa,G-CSFR的蛋白表达水平;瑞氏染色观察粒细胞集落刺激因子(G-CSF)刺激前后细胞形态;流式细胞仪检测分化抗原Gr-1,CD11b的表达.结果:筛选到分别稳定表达野生型或突变型hnRNP E2 decoy RNA的TG细胞株和TGA细胞株.与未转染组32D-P210细胞相比,TG细胞株C/EBPa mRNA水平无改变,但42ku-C/EBPa蛋白、G-CSFR mRNA和MPO mRNA水平分别升高了(43.8±4.9)%,(69.1±3.2)%和(37.8±4.2)%(P<0.05);G-CSF刺激后,TG细胞出现中、晚幼粒细胞甚至成熟粒细胞形态学特征;同时Gr-1分化抗原的表达率上升至40.3%,未转染组32D-P210细胞的Gr-1表达率5.5%(P<0.05);然而CD11b在3组细胞都是高表达,没有明显的变化(P>0.05);以上各参数在TGA细胞株与未转染组32D-P210细胞株间均无显著性差异(P>0.05).结论:hnRNP E2 decoy RNA能够诱导32D-P210细胞向粒系分化,其机制可能与decoy RNA特异性阻断hnRNAE2与C/EBPα mRNA非翻译区结合,调节C/EBPα mRNA翻译,恢复42ku-C/EBPα表达,上调其下游G-CSFR和MPO等分化基因的表达有关.G-CSF可加速这一作用从而促进32D-P210细胞的分化过程.
- 魏容曾建明袁颖王雅珍黄世峰罗红伟肖青陈新敏冯文莉
- 关键词：DECOYRNA
- β-TrCP-OD-HA重组腺病毒对白血病K562细胞凋亡的影响被引量：3
- 2010年
- 目的研究癌蛋白Bcr-Abl被泛素-蛋白酶体系统靶向降解的可能性及诱导白血病K562细胞凋亡的作用。方法含有Bcr-Abl融合蛋白N端寡聚化区(OD)的重组腺病毒Ad5β-TrCP-OD-HA特异性结合Bcr-Abl融合蛋白的N端寡聚化区(OD),通过感染将嵌合泛素连接酶β-TrCP运送到靶细胞K562细胞,同时,β-TrCP基因突变的重组腺病毒Ad5△F-TrCP-OD-HA和仅含绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒Ad5GFP,分别作为对照。感染后,Western blot检测Bcr-Abl融合蛋白的表达;倒置显微镜、光镜和电镜观察细胞形态学变化。结果成功建立携β-TrCP-OD-HA、△F-TrCP-OD-HA的重组腺病毒的K562细胞株,重组腺病毒感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组的Bcr-Abl融合蛋白含量下降,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);倒置显微镜可见Ad5β-TrCP-OD-HA作用后细胞体积变小、形态不规则;光镜下发现胞体变小,细胞质空泡,细胞核出现碎裂和凋亡小体;电镜观察到出现了典型的细胞凋亡的超微结构。结论重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA在白血病K562细胞内能够降低Bcr-Abl融合蛋白含量,并且诱导K562细胞发生了凋亡。
- 罗红伟田文君季茂胜刘钉宾王小飞黄宗干冯文莉
- 关键词：泛素连接酶K562细胞细胞凋亡
- 腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-HF2A的构建和鉴定
- ＜正＞目的:构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-HF2A,为后续研究慢性粒细胞白血病的发病机制和靶向治疗奠定实验基础。方法:HA标签通过合成5’端磷酸化的互补粘性末端引物,经退火连接入经BglⅡ和SalⅠ双酶切的...
- 黄峥兰高淼李千音罗红伟冯文莉
- 文献传递
- 一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统及其方法
- 本发明为一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统，由载入腺病毒的两个融合肽N3R、两个化合物AP21967和载入腺病毒的融合肽F2S连接在一起构成。本发明系统和方法通过实验验证，可以达到和实现诱导CML细胞凋亡，并且效果非常...
- 冯文莉黄峥兰高淼罗红伟
- 文献传递
- CTP-OD-HA融合蛋白的制备及其对BCR-ABL阳性CML细胞增殖的作用
- ＜正＞目的:用分子生物学方法制备CTP-OD-HA融合蛋白,研究其在体外培养的CML细胞株中的抑增殖效应。方法:通过重组质粒pCTP-OD-HA的克隆、转化与鉴定,CTP-OD-HA融合蛋白的诱导表达及纯化,经Weste...
- 黄世峰刘钉宾曾建明罗红伟彭智王东黄宗干冯文莉
- 文献传递
- 慢性粒细胞白血病细胞eIF4E mRNA表达及影响因素被引量：1
- 2008年
- 目的:初步探索真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)在慢性粒细胞白血病(CML)不同病程,包括慢性期(CP)、加速期(AP)、急变期(BC)、急变治疗后(BC-R)骨髓细胞中mRNA表达及其在K562细胞中的表达影响因素.方法:RT-PCR检测25例骨髓样本[CML急变期(CML-BC)10例,慢性期(CML-CP)8例,加速期(CML-AP)1例,急变期治疗后(CML-BC-R)3例,贫血对照3例]eIF4E mRNA表达,及其中9例CML eIF4E和RNA结合蛋白K(hnRNP K)mRNA表达,并分析两种基因表达相关性.用酪氨酸激酶抑制剂STI571处理K562细胞,并用hnRNP K短发夹RNA(shRNA)逆转录病毒载体感染K562细胞,经G418稳定筛选,分别检测eIF4E mR-NA表达变化.结果:与贫血对照组相比,CML-BC和CML-BC-R eIF4E mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05),而与CML-CP无统计学意义,hnRNP K与eIF4E mRNA表达呈线性相关(r=0.79,P<0.01).STI571能轻微下调K562细胞eIF4E mRNA表达.hnRNP K干扰组hnRNP K和eIF4E mRNA表达比空载对照组分别下降55.22%,55.27%.结论:CML急变期eIF4E mRNA表达显著增高,BCR/ABL融合蛋白可能参与调节eIF4E mRNA表达但效应有限,hnRNP K分子在eIF4E mRNA表达调控中可能发挥一定作用.
- 黄莲芬罗红伟肖青彭辉冯文莉
- 关键词：真核细胞起始因子4ESTI571
- 慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化被引量：5
- 2010年
- 目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。
- 季茂胜黄峥兰黄世峰曾建明刘钉宾罗红伟曹唯希冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病BCR/ABL基因原核表达
- hnRNP E2诱骗RNA对32DP-210细胞核型的影响
- ＜正＞目的:本研究初步探讨多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly（rC）-binding protein E2,hnRNP E2]诱骗RNA（decoyRNA）对小鼠BCR/ABL阳性的四倍体细胞—32DP-210细胞的作用。
- 曾建明王雅珍魏容彭智罗红伟王东陈新敏冯文莉
- 文献传递
