陆仁飞 作品数:56 被引量:81 H指数:5 供职机构: 南通市第三人民医院 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 南通市科技局资助项目 江苏省博士后科研资助计划项目 更多>> 相关领域: 医药卫生 生物学 轻工技术与工程 更多>>
不同遗传背景下QsvR调控副溶血弧菌基因表达的转录组分析 2023年 【背景】OpaR是副溶血弧菌群体感应系统的核心调控因子;QsvR是AraC家族转录调控因子,与OpaR之间具有相互调控作用;此外,QsvR对基因表达的调控作用受OpaR的影响,但是影响程度并未完全阐明。【目的】探究在野生株(wild-type,WT)和opaR基因突变株(ΔopaR)的遗传背景下QsvR的转录调控元,分析Opa R对QsvR基因表达调控的影响。【方法】分别以WT和ΔopaR为参照,采用Illumina HiSeq测序平台进行比较转录组学研究,分析生物膜形成条件下qsv R基因突变株(Δqsv R)和Δqsv RΔopaR的基因表达情况。【结果】在WT遗传背景下,QsvR共调控1735个基因的转录(调控元1),其中被激活的基因有855个,被抑制的基因有880个;在ΔopaR遗传背景下,QsvR共调控1 187个基因的转录(调控元2),其中被激活的基因有533个,被抑制的基因有654个。调控元1和调控元2之间共有517个重叠基因,且QsvR对绝大多数重叠基因的调控关系相反。基因属性分类(gene ontology, GO)数据库富集分析结果显示,调控元1和调控元2中分别有467个和204个基因注释到分子功能、细胞组分和生物学过程3个一级分类和30个二级分类;京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)对代谢途径的分析结果显示,调控元1和调控元2中分别有372和678个基因归到30个代谢通路中(Q value<0.05),调控元1中的基因主要集中在代谢、基因信息处理和环境信息处理上,而调控元2中的基因主要集中在细胞代谢通路上。蛋白相邻类的聚簇(cluster of orthologous groups of proteins, COG)数据库分类结果显示,调控元1和调控元2中的基因主要涉及氨基酸转运与代谢、信号转导、能量产生与转换、一般功能预测基因和未知功能基因等。此外,调控元1和调控元2中还含有大量调控因子基因和推定的c-di-GMP代谢基因,以及若干极生鞭毛基因、荚膜多糖基因、胞外多糖合成基因、Ⅳ型菌毛� 王健 薛星帆 张苗苗 张苗苗 杨文慧 胡凌飞 周冬生 陆仁飞 陆仁飞关键词:副溶血弧菌 转录组 磷酸神经鞘氨醇在人结肠癌中的表达及其判断结肠癌预后的研究 被引量:2 2016年 目的利用人结肠癌标本检测磷酸神经鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,s1p)及其相关激酶sphk1、sphk2的表达,研究其作为血清标记物判断结肠癌预后肿瘤标志物的价值。方法利用real-time PCR检测s1p及其相关激酶sphk1、sphk2的表达,免疫组织化学染色检测蛋白的表达及定位,并利用线性相关性分析及Kaplan-Meier曲线分析结肠癌患者血清s1p与预后的关系。结果 s1p及其受体相关激酶在人结肠癌中表达增高;sphk1在结肠癌组织中高表达;sphk2在正常组织中高表达,在结肠癌组织中表达下降;s1p的表达与sphk1呈正相关,而与sphk2的表达呈负相关;血清s1p的表达与患者的预后呈负相关。结论 s1p在结肠癌中高表达,是判断结肠癌患者术后差的生物标志物。 练维 张宏萍 陆娟 蒋兰琴 周敏 陆仁飞关键词:结肠癌 预后 三向连接构造组合引物介导的滚环扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立 被引量:1 2015年 目的建立三向连接构造(3WJ)组合引物介导的滚环扩增(PG-RCA)技术检测肠道病毒71型(EV71)的方法,并验证其检测效果。方法根据EV71的VP1基因保守区设计引物模板、引物以及环状探针前体,确立反应体系及反应条件,实时荧光PCR仪监测扩增结果。采用已建立的3WJ组合PG-RCA技术检测16例手足口病患儿咽拭子标本(EV71阳性12例、柯萨奇病毒A阳性2例、柯萨奇病毒B阳性2例)。结果已建立的3WJ组合PG-RCA技术能检测到amol级的EV71 RNA,说明方法建立成功。EV71阳性标本扩增曲线荧光强度均超过阈值;柯萨奇病毒A、B阳性标本扩增曲线荧光强度均低于阈值。结论成功建立3WJ组合PG-RCA技术检测EV71的方法,检测效果好。 周敏 张宏萍 陆仁飞 李雪梅关键词:肠道病毒71型 滚环扩增 LDR法检测HBVP基因区野生型和突变型片段 2012年 目的探讨连接酶检测反应(LDR)方法同时检测HBV P基因区野生型和突变型片段的可行性。方法针对拉米夫定、替比夫定、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读。应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性。结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBVDNA大于106copies/ml患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致。结论血清HBVDNA大于106copies/ml时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗。 赵建华 吴月平 毛丽萍 陆建荣 陈琳 陆仁飞关键词:乙型肝炎病毒 突变型 野生型 SurA通过调控鞭毛表达影响伤寒沙门菌生物膜的形成 2020年 目的:研究周质伴侣蛋白SurA对伤寒沙门菌生物膜形成能力的影响及其潜在机制。方法:用前期构建的surA基因缺陷株、缺陷空载体株及缺陷回补株的生物膜实验,观察surA基因缺失对细菌生物膜形成能力的影响。通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测影响生物膜形成的几个关键基因在surA缺陷株及野生株中的表达差异,探索surA影响细菌生物膜形成的可能通路。通过电镜实验观察surA缺陷株及野生株的鞭毛表达情况。最后通过生物膜实验观察鞭毛缺失对生物膜形成的影响。结果:与野生株相比,surA缺陷株的生物膜形成能力显著下调,缺陷株里回补surA后,细菌的生物膜形成能力恢复到与野生株相当。与野生株相比,surA缺陷株中鞭毛相关基因的mRNA水平显著下调。电镜结果显示,与野生株相比,surA缺陷株的鞭毛表达数量显著减少。鞭毛缺失株(△flhD)几乎不形成生物膜。结论:伤寒沙门菌surA基因缺陷可能通过下调鞭毛基因表达来影响生物膜形成。 韩海霞 徐芸芸 刘超 陆仁飞关键词:伤寒沙门菌 生物膜 乙型肝炎病毒B、C基因型全基因组序列的克隆 2016年 目的构建乙型肝炎病毒(HBV)B、C基因型全基因组序列克隆。方法从HBV无症状慢性携带者中筛选B、C基因型,提取病毒核酸,设计引物,应用高保真酶对3 200bp的HBV DNA进行全序列扩增,通过克隆技术构建pGEM-HBV重组质粒,测序后进行序列分析。结果获得HBV B基因型和HBV C基因型重组质粒各1株。结论成功构建HBV B基因型和HBV C基因型的全基因组序列克隆,可为进一步研究HBV分子流行病学和基础研究提供工具。 赵建华 陆仁飞关键词:乙型肝炎病毒 B基因型 C基因型 全基因组序列 克隆 生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的基因转录谱分析 2023年 【目的】探究生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的差异基因表达情况,为今后研究生物膜形成调控机制提供基因信息。【方法】以非生物膜形成条件下为参照,采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)研究,分析生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的基因表达情况,并采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)进行验证。【结果】本研究共获得979个差异显著性表达基因(differentially expressed gene,DEG),其中下调基因379个,上调基因600个。基因本体(gene ontology,GO)分类分析结果显示,共有363个DEGs注释到分子功能、细胞组分和生物学过程3个一级分类和30个二级分类;京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代谢途径分析结果显示,共有706个DEGs归到37个代谢通路中(Q value<0.05),差异表达基因主要集中在细胞代谢和转运通路上;蛋白相邻类的聚簇(clusters of orthologous groups,COG)分类结果显示,有888个DEGs可归为20个类别,涉及DEGs最多的为氨基酸转运与代谢、一般功能预测基因、能量产生与转换以及未知功能基因。qPCR验证挑选的DEGs变化趋势均与RNA-seq的结果一致。此外,从转录组数据中共筛选出10个c-di-GMP代谢相关基因、1个侧生鞭毛蛋白基因(lafA)、13个极生鞭毛合成相关基因、6个荚膜多糖合成相关基因、6个胞外多糖合成相关基因、5个IV型菌毛合成相关基因、膜融合蛋白(membrane fusion protein,Mfp)基因(cpsQ-mfpABC)、14个III型分泌系统1(T3SS1)相关基因、14个Vp-PAI基因(1个tdh2和13个T3SS2基因)、3个VI型分泌系统1(T6SS1)相关基因、6个T6SS2基因、45个推定调控子基因和15个推定的外膜蛋白基因。【结论】生物膜形成引起副溶血弧菌基因表达谱发生明显变化,差异表达基因中包含生物膜形成相关基因、关键毒力基因和许多推定调控子基因等,这为后续研究生物膜形� 黄圣勇 张苗苗 李雪 陆仁飞 张义全 周敏关键词:副溶血弧菌 生物膜 转录组 毒力 恒温滚环扩增技术检测肠道病毒71型 被引量:1 2015年 目的:建立一种三向连接构造(three-way junction formation,3WJ)组合引物介导的滚环扩增技术(primer generation-rolling circle amplification,PG-RCA)检测肠道病毒71型(EV71)。方法 :根据EV71 VP1基因保守区设计3WJ模板T、3WJ引物P以及环状探针CP前体。对EV71进行恒温滚环扩增,检测患者咽拭子中EV71。结果:建立的新的滚环扩增技术能检测到amol级的合成RNA,检测临床标本时特异性强、敏感度好。结论:3WJ组合PG-RCA恒温滚环扩增技术检测肠EV71特异性强、敏感性好、不需昂贵的PCR荧光检测仪,便于基层医院开展。 张宏萍 周敏 陆仁飞 李雪梅关键词:肠道病毒71型 滚环扩增 CalR激活副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1相关基因的转录 被引量:1 2022年 【目的】研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对calR基因以及CalR对VI型分泌系统1 (type Ⅵ secretion system 1,T6SS1;vp1386-1420)相关基因的转录调控关系。【方法】提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株的总RNA,采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)研究调控子对靶基因的转录调控关系;采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断调控子对靶基因的调控关系;将靶基因的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和调控子基因突变株中,获得LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验进一步研究调控子对靶基因的调控关系。PCR扩增靶基因的上游调控区DNA序列,并纯化His-重组调控子蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)研究His-重组蛋白对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作用,若有结合作用,则进一步采用DNase I足迹实验研究具体的结合位点。【结果】在细菌生长密度(OD600)从0.05依次增加到1.20时,CalR的表达水平呈梯度升高特征;QS系统在低细胞密度下的核心调控子AphA对calR基因的转录没有调控作用,而高细胞密度下的核心调控子OpaR对calR基因的转录具有间接的激活作用。此外,在非诱导条件下,CalR直接结合到vp1388-1390、vp1393-1406、vp1400-1406和vp1409-1407启动子区DNA序列上促进它们的转录。【结论】OpaR间接激活CalR的表达,而CalR是非诱导条件下维持T6SS1基础表达所必需的调控子。 陆仁飞 李雪 薛星帆 张苗苗 孙君芳 高鹤 周冬生 张义全关键词:副溶血弧菌 鲍曼不动杆菌耐药特征及苯唑西林酶基因分型的研究 2019年 目的:调查南通市第三人民医院鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药表型及耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)的苯唑西林酶(Oxacilllinase, OXA酶)基因分型,为临床治疗CRAB的感染和防止CRAB的播散提供帮助。方法 :运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术鉴定鲍曼不动杆菌,采用仪器法和纸片法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC),通过PCR方法检测常见的OXA酶耐药基因型。结果 :43株非重复鲍曼-醋酸钙不动杆菌复合体经PCR法鉴定均为鲍曼不动杆菌,在监测的14种抗菌药物中,耐药率≥85.0%的达10种,仅对头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素有较低的耐药率(分别为21.0%和32.6%),对亚胺培南的耐药率高达97.7%;在42株CRAB中,均检测出OXA-51-like和OXA-23-like基因,均未检测出OXA-24-like和OXA-58-like基因。结论 :本院临床分离的鲍曼不动杆菌多重耐药现象严重,携带OXA-23-like基因是我院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制,且存在CRAB的克隆流行。 刘超 魏晔 陆仁飞 赵建华 韩海霞关键词:鲍曼不动杆菌 耐药机制