王坤
- 作品数:12 被引量:34H指数:5
- 供职机构:湖南农业大学动物医学院更多>>
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- 相关领域:农业科学更多>>
- 鸡BCs原代培养贴壁性影响因素分析被引量:4
- 2015年
- 试验从鸡第X期胚胎中分离囊胚,使用含10%FBS、青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基,对鸡X期BCs进行无饲养层培养。分别在6h、12h、24h对细胞贴壁性进行评价,探究分离方法、离散程度、培养细胞密度、离心损伤对细胞培养的影响。结果表明:滤纸环法在分离胚胎上效果最好;细胞离散程度上,吹打20下效果最好,与吹打30下差异不显著(P>0.05),二者与吹打40下差异均显著(P<0.05);接种密度上,1×103个/mL和5×103个/mL两组差异不显著(P>0.05),这两组与其它组,以及其它组之间差异均显著(P<0.05),密度为1×105个/mL时效果最好,5×104个/mL次之,但密度为5×104个/mL时更方便观察;离心处理上,都离心5 min的条件下,5 590×g和1 398×g组差异不显著(P>0.05),但其与224×g处理组差异显著(P<0.05),其中5 590×g组效果最佳。因此,滤纸环法分离胚胎,吹打20下离散细胞,使用5 590×g离心5min,稀释成5×104个/mL的密度,接种到96孔板培养,可以获得较好的结果。
- 王坤张佰忠易康乐蒋隽王庆桥李昊帮燕海峰
- 关键词:原代培养
- 鸡精液稀释液储存时间与稀释比例对孵化率影响的研究被引量:9
- 2015年
- 为解决鸡精液稀释液必须现配现用且受精率不稳定等问题,试验采用前期改进的YHFB鸡精液稀释液以及配套稀释技术,选取精子活力与精液密度中上等的石门土公鸡,分精液稀释1∶1、1∶2、1∶1(稀释液保存2个月)与原精液4组,进行等温及时稀释,稀释精液与原精液等体积对石门土母鸡进行人工输精,输精后24 h收集种蛋,检测孵化指标。结果表明:13个稀释组与原精液组的受精率没有显著差异(P>0.05),1∶2组最高;21∶2组的受精蛋健雏率与入孵蛋健雏率均显著高于1∶1组(P<0.05),也高于原精液组,但差异不显著(P>0.05);31∶1(稀释液保存2个月)组,与1∶1组、原精组的孵化效果无显著差异(P>0.05)。因此,前期研制的稀释液配方、保存方法与稀释技术能解决鸡精液稀释液必须现配现用等问题。
- 周小枫黄治忠张晓华易康乐王坤肖定福燕海峰
- 关键词:精液稀释液孵化率
- 鸡囊胚细胞DMSO细管冷冻保存技术研究
- 2015年
- 旨在研究高效鸡囊胚细胞(Blastodermal cells,BCs)冷冻保存技术,为利用BCs保存禽类雌性遗传资源以及胚胎干细胞研究奠定基础。采用解冻后二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)染色以及培养24h后细胞贴壁率双重检测BCs活力方法,比较二甲基亚砜(DMSO)不同浓度、不同冷冻与解冻速率等对BCs的冷冻保存效果。结果表明:(1)DMSO不同浓度,20%组解冻后活力最高(0.58),与15%组差异不显著(P>0.05),但与5%、10%和25%组差异极显著(P<0.01);细胞复苏后贴壁率,20%组最高(30.5%),与15%组差异不显著(P>0.05),与25%组差异显著(P<0.05),与5%和10%组差异极显著(P<0.01)。(2)冷冻速率,使用三步法冷冻,以-1℃·min-1的速率降温至-7℃,保持10min,继续降温分别至-15、-35、-55、-75℃后,投入液氮中保存,-75℃组解冻后活力最高(0.53),但与-35℃、-55℃组差异不显著(P>0.05);贴壁率,各组间差异极显著(P<0.01),其中-35℃组最高(36.6%)。(3)37℃水浴解冻,10s、1min、2min、3min解冻后,各组间活力差异不显著(P>0.05),其中10s组最高(0.60),解冻后贴壁率,37℃水浴1min组结果最好(43.9%),与水浴2min组差异不显著(P>0.05),但与水浴10s组差异显著(P<0.05),与水浴3min组差异极显著(P<0.01)。50℃水浴5s、20s、40s、1min解冻,5s组活力最高(0.70),与20s组差异显著(P<0.05),与40s、1min组差异极显著(P<0.01),解冻后贴壁率,各组间差异均极显著(P<0.01),其中50℃水浴5s组最高(36.9%),50℃水浴1min组最低(5.6%)。综上表明,鸡BCs使用DMSO浓度为20%的冷冻保护剂进行细管冷冻,以-1℃·min-1的速率降温至-7℃保持10min,继续以此速率降温至-35℃后,投入液氮保存,37℃水浴1~2min解冻,BCs通过FDA染色与体外培养贴壁率双重检测均可获得较好效果。
- 王坤张佰忠易康乐朱立军蒋隽燕海峰
- 关键词:囊胚细胞DMSO冷冻保存
- 精子质量检测系统在鸡精子密度测定中的应用被引量:5
- 2015年
- 为了明确精子质量检测系统在鸡精子密度测定中的适用性,试验采用精子质量检测系统与计数板法测定黑丝羽乌骨鸡及其杂交鸡公鸡精液精子密度,比较了精子质量检测系统在鸡精子密度测定中的重复性和准确性。结果表明:该系统的重复性和一致性较好,10倍与20倍物镜检测结果无显著差异(P>0.05);该检测系统准确性较好,与计数板法测得的结果比较无显著差异(P>0.05),可以在实际研究与生产中应用。
- 王坤蒋隽易康乐张佰忠李昊帮王庆桥燕海峰
- 关键词:精子质量检测系统精液
- 稀释液渗透压与pH值对黑凤鸡精液低温保存活力的影响被引量:7
- 2015年
- 为推广鸡精液稀释技术,对黑凤鸡精液稀释液pH值与渗透压进行优化。YHFB液的渗透压调整为340、294、261mOsm/kg,按1:2对原精稀释;pH值调整为7.38、7.29、7.11,按1:1对原精稀释;先添加精液与先添加稀释液,2种稀释顺序按1:2对原精稀释。稀释后的精液,置于6℃左右,定期检查精子活力。结果表明:用不同渗透压的稀释液稀释精液后立即测定的活力差异显著(P〈0.05),以261mOsm/kg组的活力最高,但24h及以后不同渗透压组的活力差异不显著;稀释后冷藏,3种不同pH值稀释液之间、稀释液与精液不同添加次序之间精子活力差异均不显著。因此,用YHFB稀释液时黑凤鸡精液进行稀释与冷藏,低渗透压(261mOsm/kg)较好,而pH值在7.1~7.4、精液与稀释液添加次序之间没有显著差异,能获得较好效果。
- 王晓娟张佰忠蒋隽易康乐王坤曲湘勇王庆桥燕海峰
- 关键词:精液稀释黑凤鸡
- 鸡精子密度检测方法研究被引量:5
- 2014年
- 为研究一种相对准确且简单的鸡精子密度的检测方法,对黑丝羽乌骨鸡及其杂交公鸡的精液,分别运用计数板法、吸光度(精子密度仪)法和视野精子数法进行精子密度的测定,分析计数板法测定的密度与吸光度、视野精子数间的相关性。结果表明,计数板法测定的密度与吸光度之间的回归关系为幂函数回归,回归关系极显著(P<0.01);计数板法测定的密度与视野精子数之间的回归关系为直线回归,回归关系极显著(P<0.01)。因此,吸光度法和视野精子数法均能准确地测定鸡精子密度,比计数板法简单。吸光度法利用建立的标准曲线能够快速、精确测定精子密度,但需要专用的分光光度计或者精子密度仪;视野法采用便携式带液晶屏的温控显微镜,能使计数更直观简便,能相对快速准确地测定精液密度,同时还能与精子活力评价相结合,具有很好的推广应用价值。
- 王坤蒋隽朱立军易康乐王庆桥燕海峰
- 关键词:精子密度
- 鸡Ⅹ期囊胚细胞研究进展及其应用被引量:1
- 2015年
- 鸡Ⅹ期囊胚细胞(Blastodermal cells,BCs)作为潜在的胚胎干细胞,在胚胎发育动物模型、禽类转基因技术以及家禽种质资源冷冻保存等方面有广阔的应用前景。文章对鸡BCs的形态特征、体外培养、诱导分化、遗传修饰、冷冻保存、性别鉴定等体外操作方面的研究与应用进行了综述。
- 王坤张佰忠易康乐蒋隽王庆桥燕海峰
- 关键词:胚胎干细胞转基因
- 不同抗氧化剂对鸡胚盘细胞冷冻效果的影响
- 2016年
- 为探究不同抗氧化剂对鸡胚盘细胞(blastodermal cells,BCs)冷冻保存效果,试验在冷冻液中分别添加不同浓度的N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和番茄红素(lycopene,LP)3种抗氧化剂,用胚胎程序冷冻仪冻存BCs,解冻后测定细胞活率(简称"活率"),并于培养24h后测定细胞贴壁率(简称"贴壁率")。结果表明:在活率上,除了0.05mol/L NAC组(76.7%)与800U/mL CAT组(77.3%)极显著低于对照组外(P<0.01),其余各组与对照组差异均不显著(P>0.05);在贴壁率上,除了800U/mL CAT组(34.2%)极显著低于对照组(P<0.01)外,其余试验组均极显著高于对照组(P<0.01),其中NAC、CAT与LP的最佳浓度,分别为0.01mol/L(48.3%)、200U/mL(45.4%)与0.05g/L(39.8%)。因此,在冷冻液中添加适量的NAC、CAT或LP,可以提高BCs冷冻保存活率(差异不显著),极显著提高解冻BCs培养24h后的贴壁率。
- 王坤张佰忠易康乐蒋隽王庆桥燕海峰
- 关键词:胚盘细胞冷冻保存抗氧化剂活率
- 鸡精子密度检测方法研究
- 目的 计数板法检测精子密度,虽然相对准确,但方法非常繁琐.计算机辅助精子分析系统,在人、牛等精子检测领域显示出巨大的优势,但该系统在家禽领域的效果不理想.利用已知精子密度图与显微镜观察到的图像进行比较来确定精子密度,也不...
- 燕海峰易康乐王坤蒋隽李昊帮
- 黑丝羽乌骨鸡精液DMA颗粒冷冻技术研究被引量:7
- 2017年
- 为研究不同稀释液与解冻装置对黑丝乌骨鸡N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMA)颗粒冻精解冻后精子质量的影响,试验首先采用不同稀释液对精液进行稀释并比较其解冻后精子活力与人工输精的受精率;其次,选取不同解冻管及冻精颗粒数进行恒温水浴解冻,比较其活力;最后,依据解冻后的精子活力,筛选恒温水浴、恒温漏斗、恒温板3种解冻装置各自的最佳解冻温度,并利用各自最佳解冻温度解冻后的精液进行人工输精,检测受精率。结果显示:1不同稀释液组的精子活力与受精率高低趋势一致,为LR>F>B>L组,且各组之间差异显著(P<0.05)。2在60℃恒温水浴中,用薄壁大玻璃管解冻的精子活力最好。3不同解冻装置有各自最佳解冻活力的温度范围,恒温水浴为50~60℃(0.51~0.59)、恒温漏斗为40~45℃(0.42~0.46)、恒温板为50~55℃(0.61~0.63),每种装置最佳温度段内的精子活力差异不显著(P>0.05)。43种解冻装置最佳解冻状态相比:在精子活力上,60℃恒温水浴与55℃恒温板分别显著高于40℃恒温漏斗(P<0.05),但60℃恒温水浴与55℃恒温板之间差异不显著(P>0.05);在受精率上,55℃恒温板最高(26.91%),60℃恒温水浴次之(23.08%)、40℃恒温漏斗最低(20.93%),三者之间差异不显著(P>0.05)。因此,黑丝羽乌骨鸡精液应采用LR稀释液、DMA冷冻保护剂及颗粒冷冻技术,在54.9℃恒温板解冻可获得较高的受精率。
- 黄琳孙鏖朱立军彭运潮王坤贾杏林燕海峰
- 关键词:稀释液DMA颗粒冻精