马鹏鹏
- 作品数：10 被引量：19H指数：3
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 干扰GINS2表达对HL60细胞增殖和凋亡的影响被引量：6
- 2013年
- 目的:探讨靶向抑制GINS2基因表达后对人早幼粒细胞白血病细胞株HL60增殖和凋亡的影响及其机制。方法:RT-PCR分别检测GINS2基因在三株白血病细胞HL60、U937、THP-1的表达。设计与合成针对GINS2基因的干扰序列,稳定转染高表达该基因的HL60细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况;RT-PCR和Western blot分别检测各组细胞转染后mRNA和蛋白质水平;MTT法检细胞的增殖和凋亡情况;流式细胞术分析细胞的凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果:在三株白血病细胞株中,GINS2的表达量由低到高依次是:THP-1,U937,HL60。干扰质粒转染HL60细胞后,与阴性对照组及未处理组相比,干扰组GINS2的mRNA和蛋白质水平均显著降低,且细胞的增殖能力明显受抑。同时,凋亡相关蛋白Bax表达水平显著增高而Bcl2显著降低。结论:干扰GINS2基因表达后,其mRNA和蛋白质水平均显著降低,可通过上调Bax表达,下调Bcl2表达来抑制HL60细胞增殖并促进其凋亡。
- 张曦刘北忠高艳军黎亮高远梅胡秀秀马鹏鹏钟梁
- 关键词：细胞凋亡HL60细胞BAXBCL2
- 中性粒细胞弹性蛋白酶在白血病发展中的作用
- 本研究分为三部分： 第一部分、重组腺病毒Ad-HNE的构建及其对K562细胞生物学效应的影响 目的:利用AdEasy系统构建携人NE基因的腺病毒载体，在慢性粒细胞白血病细胞株K562中过表达NE，观察其对K562细胞...
- 马鹏鹏
- 关键词：中性粒细胞弹性蛋白酶白血病重组腺病毒细胞增殖
- 文献传递
- 急性早幼粒细胞白血病患者血肿瘤细胞NLS-RARα蛋白的表达与定位被引量：2
- 2015年
- 目的验证急性早幼粒细胞白血病(APL)患者血肿瘤细胞中带核定位信号的维甲酸受体α(nuclear localization signal-retinoic acid receptor alpha,NLS-RARα)蛋白的存在及定位。方法采用蛋白质印迹法验证患者血肿瘤细胞中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的存在;提取患者血肿瘤细胞核蛋白,蛋白质印迹法检测细胞核中NLS-RARα蛋白的表达;FITC/DAPI双染色免疫荧光法检测患者血肿瘤细胞中NLS-RARα的表达及定位;FITC/PI双染色激光共聚焦法检测患者血肿瘤细胞中NLS-RARα的表达及定位。以重组腺病毒Ad-NE感染的NB4细胞中NLS-RARα蛋白的表达及定位作阳性对照,以正常人血中性粒细胞中野生型RARα的表达和定位作阴性对照。结果阳性对照组设置成功。APL患者血肿瘤细胞中存在NE且有NLS-RARα蛋白表达。细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测结果提示APL患者血肿瘤细胞NLSRARα蛋白的表达主要位于胞核。结论成功用3种方法检测出APL患者血肿瘤细胞中NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位,为进一步研究APL的早期诊断及复发监测提供了新思路。
- 王慧刘北忠阳小群朱新瑜马鹏鹏蒋开玲钟梁
- 关键词：维甲酸受体Α核定位信号急性早幼粒细胞白血病
- 人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究
- 2014年
- 利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P<0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。
- 蒋开玲钟梁阳小群王慧马鹏鹏朱新瑜刘北忠
- 关键词：腺病毒NB4细胞维甲酸
- 腺病毒介导的PML(NLS^-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响被引量：3
- 2014年
- 目的利用腺病毒介导PML(NLS-)的过表达,探讨PML(NLS-)对NB4白血病细胞增殖凋亡的影响。方法重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经Pac I酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度;重组腺病毒感染NB4细胞,荧光显微成像和流式细胞术检测感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS-)的转录及表达水平,MTT实验观察细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期及凋亡。结果重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经酶切和测序鉴定正确,经4轮扩增病毒滴度为1×1010pfu/m L;重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染NB4细胞效率达75%,PML(NLS-)基因可在NB4细胞中高效表达;NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体感染组(P<0.05),S期细胞比例明显增高(P<0.05),G2期细胞比例明显减少(P<0.05);实验组细胞凋亡率明显低于空病毒感染组(P<0.05)。结论 PML(NLS-)过表达能够促进白血病NB4细胞的体外增殖能力,抑制其凋亡。
- 阳小群王慧蒋开玲朱新瑜马鹏鹏刘北忠
- 关键词：急性早幼粒细胞白血病增殖凋亡
- PML(NLS~–)蛋白在NB4细胞及其裸鼠移植瘤中定位的验证
- 2014年
- 验证中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)切割PML-RARα后,PML(NLS–)蛋白的存在和定位。将质粒pCMV-HA-NE电转染NB4细胞,用Western blot法验证质粒转染成功;提取电转染质粒成功的NB4细胞的胞浆蛋白,用Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS–)蛋白的表达;免疫荧光法和激光共聚焦检测电转染质粒成功的NB4细胞中PML(NLS–)蛋白的表达及定位;同时,建立NB4细胞、K562细胞和电转染质粒成功的NB4细胞裸鼠皮下瘤模型,用Western blot、免疫组化法检测PML(NLS–)蛋白在移植瘤组织细胞中的表达与定位。结果表明,Western blot检测电转染质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞成功表达NE蛋白;NE酶成功切割PML-RARα,Western blot检测到电转染质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞表达PML(NLS–)蛋白;免疫荧光和激光共聚焦均可检测到电转染质粒成功的NB4细胞中PML(NLS–)蛋白定位于细胞胞浆;Western blot和免疫组化法检测到电转染质粒成功的NB4细胞裸鼠移植瘤中的PML(NLS–)蛋白的表达且定位于细胞胞浆,而NB4和K562细胞裸鼠皮下瘤中PML蛋白主要定位于胞核。综上所述,该文成功将质粒pCMV-HA-NE电转染NB4细胞并用Western blot、免疫荧光、激光共聚焦、免疫组化验证PML(NLS–)蛋白存在于NB4细胞胞浆,这一现象可以为急性早幼粒细胞白血病的临床早期诊断与治疗提供新的依据。
- 朱新瑜刘北忠高远梅马鹏鹏王慧钟梁
- 关键词：急性早幼粒细胞白血病NB4细胞
- 人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。
- 张曦刘北忠钟梁高远梅胡秀秀王慧马鹏鹏朱新瑜
- 关键词：腺病毒HL60细胞基因表达
- 中性粒细胞弹性蛋白酶的过表达促进K562细胞增殖并抑制其凋亡被引量：3
- 2015年
- 目的利用Ad Easy系统构建携带人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)基因的重组腺病毒表达质粒,并感染K562细胞,观察其对K562细胞增殖和凋亡的影响。方法以急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株HL-60的RNA为模板,经反转录PCR得到NE基因的编码区并克隆入穿梭载体p Ad Track-CMV,得到p Ad-NE,经HindⅢ、EcoRⅤ酶切鉴定和测序正确后,将其转化入p Ad Easy-1-BJ5183进行同源重组,得到重组子Ad-NE,经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞进行包装。14 d之后收获原代病毒,经5轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。感染K562细胞后,荧光显微镜初步观察感染效率,同时用流式细胞术检测感染效率;Western blot法进一步鉴定NE是否表达上调;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期变化。结果酶切鉴定及测序结果表明重组穿梭质粒p Ad-NE构建成功;酶切鉴定显示同源重组成功,得到重组子Ad-NE;荧光显微镜表明病毒包装成功;经过5轮扩增后,病毒滴度达到1.64×1012pfu/m L;感染K562细胞后,荧光显微镜观察感染效率达80%左右;Western blot法检测到NE表达上调;CCK-8实验显示NE表达上调后K562细胞增殖能力增强;流式细胞术显示S期细胞明显增多并且细胞凋亡减少。结论过表达NE可促进K562细胞增殖并抑制其凋亡。
- 蒋开玲马鹏鹏阳小群钟梁王慧朱新瑜刘北忠
- 关键词：中性粒细胞弹性蛋白酶重组腺病毒增殖凋亡K562细胞
- 中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂对U937细胞增殖和凋亡的影响被引量：3
- 2013年
- 目的比较两种中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抑制剂GW311616A和西维来司钠（sive—lestat）对U937细胞增殖和调亡的影响。方法采用四唑蓝比色试验（MTT）检测细胞增殖抑制率；用透射电镜观察细胞形态学变化；用流式细胞术检测细胞凋亡[膜联蛋白V／碘化丙锭（AnnexinV／PI）双标记法]及细胞周期变化；应用间接免疫荧光法观察细胞内NE表达水平；同时利用ELISA法和比色法检测细胞内NE含量和活性的变化。使用SPSS13．0软件对所得数据进行统计分析，采用完全随机设计资料的方差分析和Dunnett—t检验对各处理组数据进行比较。结果MTr法检测结果显示两种药物均能抑制U937细胞的增殖，且具有一定的剂量依赖效应，GW311616A和西维来司钠的Ic50值分别为150、214μmol／L。GW311616A对U937细胞的增殖抑制作用高于西维来司钠（P〈0．01）；电镜结果显示两种药物处理的U937细胞均能看到典型的细胞凋亡形态；AnnexinV／PI双标记法结果表明两种药物均能引起U937细胞的早期凋亡，GW311616A（150μmol／L）组的凋亡率为13．60％，西维来司钠组（150μmol／L）为3．69％，GW311616A对其凋亡的影响比西维来司钠更明显（P〈0．01）；流式细胞术检测结果显示GW311616A（150μmol／L）组的凋亡率为14．61％，细胞周期主要阻滞于G2／M期，西维来司钠（150μmol／L）组的凋亡率为4．25％，细胞周期主要阻滞于S期；间接免疫荧光法检测结果显示GW311616A组荧光强度明显减弱，而西维来司钠组荧光强度未明显减弱；ELISA和比色法结果显示两种药物均能使U937细胞内NE含量和活性降低，但GW311616A对他们的影响大于西维来司钠（P〈0．01）。结论GW311616A和西维来司钠均能抑制U937细胞的增殖，引起其凋亡，但前者比后者更有效，更能造成细胞的损伤。
- 马鹏鹏朱丹刘北忠钟梁朱新瑜王慧张曦高远梅胡秀秀
- 关键词：弹性蛋白酶抑制剂U937细胞细胞凋亡
- NLS-RARα蛋白在重组腺病毒Ad-NE感染的NB4中定位的验证被引量：4
- 2014年
- 该实验主要验证重组腺病毒Ad．NE感染NB4细胞后，NLS-RARa蛋白的表达及其定位。用重组腺病毒Ad-NE感染NB4细胞，检测感染效率，分别用RT-PCR和Westernblot法在mRNA水平和蛋白水平验证转染成功：提取转染成功的NB4细胞的核蛋白，Westernblot法检测细胞核中NLS—RARα蛋白的表达；FITC—AnnexinV／DAPI双染色免疫荧光法检测转染成功的NB4细胞NLS-RARα的表达及定位；FITC—AnnexinV／PI双染色激光共聚焦法检测转染成功的NB4细胞中PNLS-RARα的表达及定位。结果显示，重组腺病毒Ad—NE和阴性对照腺病毒Ad-KZ对NB4细胞的感染效率可达70％～80％。RT-PCR和Westernblot结果显示，感染了重组腺病毒Ad—NLS-RAR的NB4细胞成功表龇基因和NE蛋白，且有NLS．RARa的蛋白表达。用细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测出已感染的NB4细胞中NLS—RARer蛋白的表达，并推测其主要定位于胞核。综上所述，该文成功用重组腺病毒Ad-NE感染NB4细胞，并用Westernblot法、免疫荧光法、激光共聚焦法验证了NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位，为进一步研究急性早幼粒细胞白血病的早期诊断及复发监测提供了新的思路。
- 王慧钟梁蒋开玲朱新瑜马鹏鹏阳小群刘北忠
- 关键词：腺病毒NB4急性早幼粒细胞白血病
