林晓琳
- 作品数：20 被引量：30H指数：3
- 供职机构：南方医科大学基础医学院肿瘤研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省科技计划工业攻关项目广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学航空宇航科学技术更多>>
- 慢病毒载体法制备遗传工程猴和小型猪的现状及应用前景展望
- 较小鼠等啮齿类动物而言，猴和小型猪等大型实验动物在亲缘关系上与人类更为接近，在解剖、生理生化代谢及疾病发病机制等多方而与人类更接近，使它们在复制人类疾病模型，研究疾病发病机制和新药研发等中有无可替代的应用。而制备遗传工程...
- 刘薇贾俊双唐华林晓琳袁进顾为望肖东
- 关键词：小型猪体细胞核移植
- 基于Tet-On系统构建Alb启动子调控猪uPA转基因表达的慢病毒载体被引量：2
- 2019年
- 目的应用Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控小型猪uPA (pig urokinase-type plasminogen activator,puPA)基因表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG)。方法首先将pAlb-Cre-GH/BS作为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Xho I/Xba I双酶切的pLVX-TetOne中,获得Alb启动子替换pLVX-TetOne原有的PGK启动子的质粒pLVX-Alb-TetOne;接着以pCD823 A-1为模板,PCR扩增T2A-CopGFP,In-Fusion克隆至BamH I/Age I酶切的pLVX-Alb-TetOne中,获得pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG);最后以H8803为模板,PCR扩增puPA(3′端含Flag标签),In-Fusion克隆至pLATTTG中,最终获得慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP (pLATTPUTG);所构建的质粒均经酶切和测序鉴定。pLATTPUTG瞬转293T细胞,转染24 h后倒置荧光显微镜检测绿色荧光;随后六孔板内加入强力霉素(Dox),48 h后倒置荧光显微镜下检测CopGFP表达(包括未加Dox的孔),接着收集细胞以抽提总RNA和总蛋白,以用于qRT-PCR检测puPA和CopGFP表达及Western blot检测Flag表达。结果酶切鉴定和测序证实成功构建了慢病毒载体pLATTPUTG。pLATTPUTG转染293T细胞,24 h后倒置荧光显微镜下未见绿色荧光,而加入Dox 48 h后几乎所有细胞均发强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然未见绿色荧光;加Dox的孔内细胞上puPA、CopGFP和Flag表达水平均显著升高,而不加Dox的孔内细胞上检测到上述基因极低表达;以上数据提示,应用该Tet-On基因表达调控系统实现了puPA基因在293T细胞上可诱导性表达。结论成功基于Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控puPA转基因表达的慢病毒载体pLATTPUTG,这为相关后续研究奠定了坚实基础。
- 刘宇陈恒伟温悦婷贾俊双林晓琳肖东
- 关键词：慢病毒载体
- 乙醇喂养小鼠诱导肝损伤模型的制作
- 2022年
- 目的:通过慢性酒精喂养加急性酒精灌胃来制作肝损伤的小鼠模型。方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和模型组。前十天每天给予对照组不含酒精液体饲料喂养,给予模型组酒精液体饲料喂养,第十一天给对照组灌胃麦芽糊精溶液(20 μL/Kg),模型组灌胃酒精(20 μL/Kg)。实验结束后检测血清肝功能指标、脂质代谢相关指标,并观察肝脏组织病理变化。结果:与对照组小鼠比较,模型组小鼠血清中胆固醇(P 0.05, n = 14~15)在实验组中均高于对照组,且胆固醇(P < 0.01, n = 14~15)在两组间有显著差异。苏木精–伊红结果显示,与对照组相比,造模组的肝组织破坏程度较重。结论:模型组小鼠出现了肝细胞损伤,脂肪累积,运用慢性喂养加上急性灌胃的方法成功模拟酒精肝损伤,这对于之后的临床治疗和新机制的研究具有实践意义。
- 黄世豪林丽珍李永龙夏加伟赵文淘韩留鑫李迎春李迎春何丹华丛金格沈含章贾俊双贾俊双林晓琳肖东
- 关键词：酒精性肝损伤小鼠模型
- 稳定过表达miR-26a肝癌细胞株的建立被引量：3
- 2013年
- 目的建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株。方法以CTE049质粒为模板,PCR扩增miR-26a序列418bp,片段两侧添加XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点,In-Fusion克隆至pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen中,次日挑选单菌落,提取质粒并进行测序和酶切鉴定;所构建的载体命名为pLVT-miR26a。获得pLVT-miR26a后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR-26a和ZsGreen基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞(Hep1-6)、人肝癌细胞(BEL-7402、HepG2、Sk-Hep-1、HepG2-luc),以建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞系;qRT-PCR检测所建立肝癌细胞系中miR26a的表达水平。结果测序和酶切证实成功构建了pLVT-miR26a,按标准程序生产的携带miR-26a和ZsGreen基因的慢病毒上清成功感染小鼠及人肝癌细胞。结论成功建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株,为相关后续研究打下了良好基础。
- 赵文淘赵尊兰史俊文王胜纯林晓琳李静姚开泰肖东
- 关键词：慢病毒载体肝癌
- 过表达西藏小型猪GHR显负性突变体的慢病毒载体构建及其功能验证被引量：1
- 2016年
- 目的:构建过表达西藏小型猪GHR基因显负性突变体的慢病毒载体,并对其进行功能验证。方法:首先以pRLG3A为模板,PCR扩增CAG启动子,In-Fusion克隆至Cla I/BamH I双酶切的pCD550A-1载体中,替换其EF1α启动子,获得pCAGGP;然后从西藏小型猪肝脏组织cDNA中PCR扩增GHR基因的显负性突变体片段(dnGHR);最后将dnGHR片段插入pCAGGP多克隆位点,最终得到过表达猪GHR显负性突变体的慢病毒载体pCdnGGP。对所构建的质粒进行测序和酶切鉴定。将所构建的pCdnGGP载体转染293T细胞,并将包装好的慢病毒感染猪的胚胎成纤维细胞(PEFs),倒置荧光显微镜检测GFP表达,收集细胞并提取总RNA检测dnGHR基因在293T细胞和PEFs中的表达,以对pCdnGGP进行体外功能验证。结果:测序和酶切证实成功构建了pCdnGGP。pCdnGGP转染293T细胞以及病毒感染PEFs之后,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR检测证实dnGHR在293T细胞和PEFs中均能正常表达。结论:成功构建过表达猪GHR基因显负性突变体的慢病毒载体,为相关后续研究打下了良好基础。
- 贾俊双林晓琳肖东刘薇
- 关键词：西藏小型猪GHREGFP慢病毒载体
- 基于四环素调控系统构建白蛋白启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体
- 2019年
- 基于四环素调控系统构建白蛋白(albumin,Alb)启动子调控大鼠uPA(urokinase-type plasminogen activator,ruPA)转基因肝特异性过表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG)。以CTG0875-2-11质粒为模板,PCR扩增大鼠的uPA(ruPA)基因,3’端添加Flag标签,In-Fusion克隆至pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG)质粒中,得到慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG),所构建质粒经测序和酶切鉴定。将pLATTRUTG瞬时转染293T细胞,转染后24 h倒置荧光显微镜检测CopGFP表达;接着向6孔细胞培养板内加入强力霉素(Doxycycline,Dox),48 h后在倒置荧光显微镜下观察CopGFP表达(包括未加Dox的孔),随后收集细胞以提取总RNA和总蛋白,用于RT-qPCR检测ruPA及报告基因表达和Western blot检测标签蛋白Flag表达。酶切和测序确证我们成功构建了慢病毒载体pLATTRUTG;瞬转293T细胞后,24 h倒置荧光显微镜下可见零星细胞(约占0.1%)发弱的绿色荧光,加Dox 48 h后所有细胞展现强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然只见到零星细胞(约占0.1%)发弱的绿色荧光。RT-qPCR和Western blot检测结果显示,与不加Dox的细胞相比,加Dox的细胞中ruPA、报告基因CopGFP和Flag表达水平显著升高。结果提示,成功基于四环素调控系统构建Alb启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体pLATTRUTG,为相关后续实验奠定了基础。
- 张晟黎海燕廉梅刘宇肖东林晓琳
- 关键词：慢病毒载体
- 利用高压水枪法将双报告基因导入小鼠肝脏
- 2016年
- 目的:通过高压水枪法将双报告基因[即绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)]导入小鼠肝脏,以熟练掌握高压水枪法,其将为后续相关研究奠定方法学基础。方法:将质粒pcEF.luc-IRES-GFP瞬时转染入人肝癌细胞SMMC-7721以进行载体体外功能验证,并利用高压水枪法将质粒pcEF.luc-IRES-GFP经尾静脉注射入小鼠肝脏内,经小动物活体成像系统活体检测GFP和Luc信号,同时免疫组化检测GFP在肝组织中的表达情况。结果:瞬转结果显示,7721细胞上可检测到GFP和Luc表达;利用高压水枪法将pcEF.luc-IRES-GFP导入小鼠肝脏后,利用小动物活体成像仪成功在肝内检测到GFP和Luc信号;免疫组化结果显示部分肝细胞表达GFP。结论:成功掌握了将目的基因导入小鼠肝脏的高压水枪法,这为相关后续研究打下良好基础。
- 贾俊双林霞罗冰敏陈丽刘宇肖东林晓琳
- 关键词：尾静脉肝脏
- 小鼠棕色脂肪转基因过表达miR-155损坏棕色脂肪细胞的分化被引量：3
- 2019年
- 为探究microRNA-155(miR-155)对小鼠棕色脂肪组织分化的影响,收集广泛过表达miR-155的转基因小鼠(RL-m155小鼠)棕色脂肪组织,离体棕色脂肪大体拍照,然后收集部分组织固定、石蜡包埋和切片,并行HE染色,观察棕色脂肪细胞的大小和形态;同时RT-qPCR检测棕色脂肪组织中分化相关基因的表达水平。结果表明,RL-m155小鼠的体重、体型与对照小鼠无显著差异;与对照小鼠相比,RL-m155小鼠棕色脂肪组织中miR-155表达水平显著升高,而棕色脂肪组织体积及棕色脂肪细胞的大小均显著减小;棕色脂肪中特异表达基因(UCP1和SCA-1)、棕色脂肪分化调控因子(BMP2、BMP6、Smad1、Smad5、C/EBPB、MYO10和PTEN)、棕色脂肪分化诱导因子(PPARγ、PGC-1α、BMP2、BMP4、BMP7、BMPR1A和Sirt1)等棕色脂肪分化相关功能基因的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。表明RL-m155小鼠棕色脂肪组织中miR-155过表达,导致棕色脂肪组织分化受损。
- 黎海燕刘宇廉梅陈恒伟温悦婷贾俊双林晓琳肖东
- 关键词：棕色脂肪肥胖
- 非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的构建
- 2022年
- 目的:构建特殊饲料饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)小鼠模型。方法:将40只8周龄的C57BL6/J雄性小鼠分成四组,分别予以高脂高果糖高胆固醇饮食(FFC)及对照饮食喂养4个月、6个月,期间每周称量小鼠体重,分别于喂养4个月和6个月取材,取动物血清和肝脏,进行血清学检测与肝组织病理学检测。结果:与对照组相比,FFC组体质量(P < 0.05)、肝湿重(P < 0.01)和肝体比(P < 0.01)均显著升高;FFC组脂肪变性明显比对照组严重(P < 0.001);FFC组肝脏甘油三脂较对照显著升高(P < 0.001),FFC组血清总胆固醇(TC)显著高于对照组(P < 0.001),FFC组血清ALT (P < 0.05)、AST (P < 0.001)较对照显著升高。而且,FFC饮食喂养6个月比喂养4个月的小鼠具有更为严重的NASH疾病特征。结论:建立了不同严重程度的NASH小鼠模型,为研究NASH发病机制以及治疗等研究提供模型参考。
- 戴冠齐林锦涛李永龙韩留鑫赵文淘夏加伟李迎春黄世豪何丹华丛金格贾俊双林晓琳肖东申红芬
- 关键词：非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型
- 二乙基亚硝胺对肝脏过表达miR-155转基因小鼠肝癌发生的影响被引量：1
- 2019年
- 目的建立诱发性肝癌模型,观察miR-155转基因小鼠肝癌发生情况及相关基因表达变化。方法制备Rm155LG转基因小鼠,并行可视化筛选和PCR验证。利用小动物活体成像仪筛选Rm155LG/Cre双转基因小鼠,并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-155转基因在Rm155LG/Cre双转基因小鼠肝脏中的表达。分别对Rm155LG/Cre双转基因小鼠和同窝对照小鼠腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN),6个月后取材行肝脏大体形态观察,并通过Western-blot分析肝癌相关基因的表达变化。结果 Luc和miR-155转基因在Rm155LG/Cre双转基因小鼠的肝脏上成功被激活。腹腔注射DEN后,与同窝对照小鼠相比,Rm155LG/Cre双转基因小鼠肝脏癌结节增多,肝癌相关基因表达上调。结论在Rm155LG/Cre双转基因小鼠上实现了miR-155转基因的肝脏特异激活,并且利用Rm155LG/Cre双转基因小鼠,初步证明了miR-155对DEN诱导的小鼠肝癌的发生有促进作用,这为后续研究miR-155在肝癌发生发展和转移中的作用奠定了坚实的基础。
- 陈丽林霞关燕红林晓琳肖东杜弢
- 关键词：肝癌MIR-155CRE/LOXP系统转基因小鼠二乙基亚硝胺
