芦永良
- 作品数：12 被引量：26H指数：3
- 供职机构：重庆医科大学基础医学院分子医学与肿瘤研究中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Wnt3a诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化
- 2013年
- 目的探讨Wnt3a对小鼠肝前体细胞发生上皮-间质转化的影响。方法将表达Wnt3a的腺病毒Ad-GFPWnt3a转入小鼠肝前体细胞中,与空白对照组相比,观察其形态变化。细胞划痕实验和细胞迁移实验观察其对小鼠肝前体细胞迁移能力的影响。实时荧光定量Real-time PCR和Western blot分别检测小鼠肝前体细胞中上皮标志物和间质标志物的表达改变。结果镜下观察,高表达Wnt3a的小鼠肝前体细胞由不规则多边形变为长梭形。细胞划痕实验结果显示,Ad-Wnt3a组细胞48h迁移距离为(0.53±0.05)mm,Ad-GFP组细胞48 h迁移距离为(0.33±0.02)mm,相对对照组,其迁移距离增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞迁移实验结果显示,Ad-GFP组24 h穿过小孔的细胞为(10.33±2.08)个,而Ad-Wnt3a组穿过的细胞为(62.00±3.60)个,相对对照组,其穿过小孔的细胞数量增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR和Western blot结果显示,间质标志物N-cadherin、vimentin和snail的mRNA和蛋白水平表达上调,相反上皮标志物E-cadherin和CK-18的mRNA水平和蛋白水平表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Wnt3a能够促使小鼠肝前体细胞发生上皮-间质转化,提示其可能参与了肝纤维化的发展进程。
- 胡代曦张锡峰芦永良冯涛黄佳祎
- 关键词：WNT3A上皮-间质转化
- Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响被引量：2
- 2013年
- 目的探讨Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响。方法将细胞分为4组:阴性对照组(即空白组)、实验对照组(感染Ad-GFP组)、阳性对照组(50 ng/ml RANKL诱导组)、实验组(感染Ad-Wnt3a组)。分别给予处理因素后常规细胞培养6 d,通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞的分化成熟情况;Western blot检测TRAP、Cathep-sin K蛋白的表达;分别于处理因素后3、6、9 d提取细胞总RNA,荧光定量Real time(RT-PCR)检测核因子κB受体(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的表达。结果TRAP染色显示50 ng/mL RANKL诱导组能成功诱导RAW 264.7成多核(核≥10),空白组和Ad-GFP组有少量多核细胞(3≤核≤5),Ad-Wnt3a组为单核有个别双核;Western blot检测显示Ad-Wnt3a组TRAP、Cathepsin K蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测Ad-Wnt3a组能下调RANK、TRAP、Cathepsin K、MMP-9基因的表达。结论Wnt3a能抑制RAW264.7分化成成熟的破骨细胞。
- 李红丽申利红芦永良冯涛黄佳祎
- 关键词：WNT3ARANKLTRAP
- 稳定表达HBX蛋白的肝干细胞株的构建和鉴定
- 目的:构建稳定表达HBX的肝干细胞株,为进一步研究HBX蛋白对肝干细胞增殖、分化的影响奠定了基础。方法:将重组质粒pSEB-Flag-HBX转染至HEK 293细胞,包装产生逆转录病毒;病毒感染肝干细胞,稻瘟菌素(Bla...
- 芦永良申利红李红丽黄佳祎冯涛
- 关键词：HBX肝干细胞
- 文献传递
- Wnt3a过表达对小鼠胚胎肝干细胞凋亡的抑制作用被引量：5
- 2013年
- 目的研究Wnt3a对ELSC14.5小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法采用表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体系统(Ad-GFP-Wnt3a)转入小鼠ELSC14.5细胞,以Ad-GFP组为空白对照组,Ad-wnt3a组为实验组。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测Wnt3a及凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Mcl-1的mRNA和蛋白的表达;Hoechst33258染色法结合annexin-PE/7-ADD法检测细胞的凋亡情况。结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3a在ELSC14.5细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3a能高效感染ELSC14.5细胞。与对照组相比,抗凋亡因子Bcl-2、mcl-1的mRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.05),而促凋亡因子Bax的mRNA和蛋白的表达显著降低(P<0.05)。Hoechst33258染色结合annexin-PE/7-ADD法结果显示,Wnt3a高表达的ELSC14.5细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染的细胞数量很少,细胞凋亡率降低。结论 Wnt3a通过上调Bcl-2家族中抗凋亡因子和下调促凋亡因子来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,延长其生存。
- 张锡峰胡代曦芦永良冯涛黄佳祎
- 关键词：抗凋亡WNT3A
- 侧脑室注射链脲佐菌素致大鼠脑内胰岛素通路障碍和认知水平降低被引量：8
- 2013年
- 目的:本文旨在研究胰岛素信号通路在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)发病中的作用,并探讨其可能的作用机制。方法:于实验第1 d和第3 d侧脑室(intracerebroventricular,ICV)注射链脲佐菌素(streptozo-tocin,STZ;3 mg/kg)建立大鼠模型。第1次注射后21 d采用Morris水迷宫检测大鼠的学习和记忆水平;采用West-ern blotting检测胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK-3β)、tau和磷酸化tau(p-tau)的表达;采用免疫组化检测淀粉样β蛋白(Aβ1-40和Aβ1-42)在大脑皮质的沉积;用real-time RT-PCR法检测胰岛素、胰岛素受体、tau、IDE mRNA的表达。结果:Morris水迷宫结果显示ICV-STZ明显降低大鼠的认知能力(P<0.05);Western blotting结果显示ICV-STZ能降低IDE的表达,增加GSK-3β的活性和tau的磷酸化水平(P<0.05);免疫组化结果显示ICV-STZ处理的大鼠大脑皮质Aβ1-40和Aβ1-42均明显增加;PCR结果显示ICV-STZ处理的大鼠大脑胰岛素和胰岛素受体的mRNA水平均降低,IDE mRNA的水平亦下降。结论:ICV-STZ通过影响脑内胰岛素通路导致大鼠出现AD样行为学及病理改变,表明胰岛素信号通路在AD发病中可能起到了一定的重要作用。
- 杨文青马晶刘争芦永良余华荣
- 关键词：阿尔茨海默病胰岛素淀粉样Β蛋白胰岛素降解酶糖原合成酶激酶3Β
- HBx对小鼠肝前体细胞株Hp14.5的增殖和上表皮间质化的影响的影响
- 目的：利用HBx逆转录病毒感染小鼠肝前体细胞HP14.5，构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的小鼠肝前体细胞株。检测HBx对小鼠肝前体细胞增殖、细胞周期、上皮-间质转化，以及wnt/β-catenin信号通路的影响...
- 芦永良
- 关键词：肝前体细胞细胞周期
- 稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响被引量：4
- 2013年
- 目的构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组。MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期中各时相所占的比例,荧光定量PCR检测cyclin D1和c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测HBx、GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达。结果 RT-PCR和Westernblot法检测到HBx基因和蛋白阳性表达,与对照组相比,HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(P<0.05);G1细胞比例明显减少(P<0.05),S期和G2细胞比例显著升高(P<0.05);cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(P<0.05);GSK3β蛋白水平表达无明显变化(P>0.05),p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。结论成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株,HBx通过活化Wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖。
- 芦永良申利红李红丽胡代曦张锡峰胡斌冯涛黄佳祎
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白肝前体细胞WNT
- HBx诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化被引量：3
- 2013年
- 目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)能否诱导肝前体细胞(HPCs)发生上皮-间质转化(EMT)。方法将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,经稻瘟菌素(blasticidin)筛选,获得稳定表达HBx的HP14.5细胞。观察其形态变化,通过实时定量PCR(real time-PCR)及Western blot法检测其间质细胞标志物和上皮标志物在mRNA和蛋白水平的表达量,并采用划痕实验检测其细胞迁移能力的变化。结果 HP14.5细胞稳定表达HBx蛋白后细胞由多角形变为长梭形;与对照组相比,神经钙黏素(N-cadherin)、Snail、vimentin的mRNA和蛋白水平表达均升高,具有统计学差异(P<0.05)而上皮性钙黏素(E-cadherin)、细胞角蛋白18(CK18)的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05;同时其迁移能力显著升高(P<0.05)。结论 HBx能诱导肝前体细胞发生EMT,并增强其迁移能力。
- 芦永良申利红李红丽胡代曦张锡峰冯涛黄佳祎
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白肝前体细胞上皮-间质转化
- 乙肝病毒X蛋白对肝前体细胞中β-连环素表达及定位的影响被引量：1
- 2013年
- 目的探讨乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B Virus X,protein,HBx)对肝前体(Hepatic progenitor,HP)14-19细胞中β-连环素(β-catenin)表达及定位的影响,为研究HBV相关性肝癌的发生机制提供实验依据。方法分别用重组腺病毒Ad-GFP-HBx和Ad-GFP感染HP 14-19细胞,RT-RCR法检测HBx基因mRNA的转录;Real-time PCR法检测β-catenin基因mRNA的水平;Western blot法检测HBx、总糖原合成酶激酶3β(total-glycogen synthase kinase 3β,t-GSK3β)、磷酸化GSK3β(Phospho-GSK3β,p-GSK3β)及β-catenin蛋白的表达;免疫细胞化学法检测β-catenin的分布情况。结果重组腺病毒Ad-GFP-HBx和Ad-GFP均能高效感染HP 14-19细胞,感染效率均可达到90%;在重组腺病毒Ad-GFP-HBx感染的HP 14-19细胞中可检测到HBx基因mRNA的转录和蛋白的表达;与Ad-GFP感染组相比,Ad-GFP-HBx感染组t-GSK3β蛋白相对表达量无明显变化(P>0.05),但p-GSK3β蛋白相对表达量增加(P<0.05);β-catenin在基因和蛋白水平上表达明显增高(P<0.05),并在胞质中大量积聚,且有向胞核转位的趋势。结论 HBx可通过促进HP 14-19细胞中GSK3β磷酸化,抑制β-catenin的降解,从而导致β-catenin在胞质中大量积聚并向核内转移。HBx对肝前体细胞中经典Wnt信号通路的激活,可能是导致肝前体细胞恶性转化的分子基础。
- 申利红芦永良李红丽吴迪冯涛黄佳祎
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白Β-连环素肝前体细胞肝癌WNT信号通路
- 全反式维甲酸诱导肝前体细胞向肝细胞分化的研究
- 2012年
- 目的:探讨全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)对肝前体细胞分化的影响。方法:取孕14.5 d胎鼠制备肝前体细胞,瞬时转染带白蛋白启动子(Albumin promoter)的荧光素酶报告质粒pALB-Luc,以便实时检测细胞的分化状态。优化ATRA诱导条件,分别于诱导后3、6、9 d收集细胞总RNA,半定量RT-PCR检测分化相关指标的变化。并于诱导后11 d用苏木精-伊红染色法观察细胞形态的改变,PAS染色观察细胞的分化成熟程度。结果:ATRA浓度为1μmol/L时对肝前体细胞分化诱导作用最强。与对照组相比,随培养时间的延长,ATRA组分化早期指标膜蛋白(Delta like,DLK)、细胞角蛋白(Cytokeratin19,CK19)表达降低更为明显,而甲胎蛋白(Alpha fetal protein,AFP)、白蛋白(Albumin,ALB)表达更为升高。形态学观察细胞体积增大,呈多边形,核浆比率降低,相嵌紧密排列,可见双核细胞。PAS染色阳性率上升。结论:浓度1μmol/L的ATRA对肝前体细胞分化诱导作用最强,ATRA能诱导肝前体细胞分化为类肝细胞。
- 白光文李红丽申利红芦永良冯涛
- 关键词：肝前体细胞全反式维甲酸诱导分化
