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上海市零售禽肉制品和活禽中沙门氏菌血清型与耐药性研究被引量：22: 2014年; 为掌握上海市沙门氏菌在农贸市场和超市禽肉制品和活禽中的污染状况、流行血清型和耐药情况,本试验从320份2012年采集的禽肉样本(240份)和活禽泄殖腔棉试子(80份)中共分离鉴定出沙门氏菌70株,阳性率为21.9%。血清型鉴定结果表明,共鉴定出11种不同的血清型,其中肠炎沙门氏菌占47.1%、印第安纳沙门氏菌占17.1%、鼠伤寒沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌均占8.6%。通过纸片法对这70株沙门氏菌进行了16种常用抗菌药物的药敏试验,结果表明,沙门氏菌对奈啶酸耐药率最高,达75.7%,对磺胺异唑、链霉素和氨苄西林耐药率较高,分别为60.0%、60.0%和51.4%。除亚胺培南外,其他药物均有不同程度的耐药菌株。有40株(57.1%)沙门氏菌呈多重耐药表型,耐药性最强的菌株可以对14种抗菌药产生耐药性。本研究对沙门氏菌病的防控及指导临床合理用药具有重要的现实意义。; 沈海燕郭慧霞许学斌周恒刘志成张春红; 关键词：沙门氏菌血清型耐药性

猪圆环病毒2型广东分离株ORF2基因的克隆和序列分析被引量：2: 2014年; 为了解广东部分地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）流行毒株的基因型和遗传变异情况,本研究根据GenBank中PCV2的核苷酸序列设计针对ORF2基因的1对特异性引物,从分离于广东省的8株PCV2分离株BL、HD、Li、GD01、GD02、HD01、HD02和HD03株的细胞培养物中扩增ORF2基因,扩增片段克隆到pMD18-T上,获得重组质粒,并对其进行测序。序列分析结果表明,8株PCV2分离株ORF2基因与其他PCV2 ORF2基因核苷酸序列同源性为89.7%~100%,氨基酸序列同源性为87.2%~99.6%,进化分析结果表明,其中7株分离株处于同一分支,属于PCV2b-1A/1B,HD01株属于PCV2b-1C。; 沈海燕刘志成郭慧霞周恒朱余军张春红; 关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因

H7N9亚型禽流感病毒HRM检测方法的建立被引量：3: 2016年; 根据H 7N 9亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守区域,分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了基于高分辨率熔解曲线(HRM)分析的H7N9亚型AIV检测方法。结果显示,该方法特异性强,其他常见禽源病毒及非H7亚型和非N9亚型的AIV不能形成特异熔解峰形;灵敏度高,对H7和N9阳性质粒的最低检测限分别达到1.0×101 copies/L和1.0×100 copies/L;重复性好,熔解峰Tm 1和Tm2的批内和批间变异系数均<1%;临床样本检测与某商品化H7N9亚型AIV定量PCR检测试剂盒比较,符合率为100%。该方法可用于临床疑似病例的应急检测、早期诊断及养鸡场、活禽交易市场等外环境H7N9亚型AIV的监测。; 刘志成贾伟新孙敏华沈海燕孙俊颖殷三鸿钟亮宁张建峰张春红; 关键词：禽流感高分辨率熔解曲线

RNA干扰抑制ST细胞Ⅰ型干扰素受体-2表达的研究: 2016年; 应用RNA干扰技术建立猪睾丸(ST)细胞Ⅰ型干扰素受体-2(IFNAR-2)基因knock down模型。采用FuGENE HD转染剂将pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3干扰载体分别转染ST细胞,经荧光定量PCR和Western blot分别检测IFNAR2mRNA和蛋白水平表达变化。结果显示,与对照组比,转染干扰载体组均可明显降低IFNAR2 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。RNA干扰技术能够有效抑制IFNAR2基因的表达,为进一步研究IFNAR2基因的生物学功能提供可靠的手段,为研究IFNAR2在病毒感染中的作用奠定基础。; 沈海燕张春红刘志成孙俊颖卢宇张建峰; 关键词：RNA干扰 ST细胞

重组猪IFN-λ3原核表达及其活性分析被引量：2: 2015年; 应用RT-PCR技术从多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly(I∶C))刺激的ST细胞中扩增猪干扰素-λ3(PoIFN-λ3)基因。基因序列分析表明,PoIFN-λ3基因全长为588bp,与绵羊IFN-λ3基因(XM_004015683)的同源性最高(87.6%);分子遗传进化树分析表明猪IFN-λ3与牛、绵羊亲缘关系最近,与马、人、黑猩猩和鸡的亲缘关系次之。将PoIFN-λ3成熟肽序列定向插入pET-32a载体,转化宿主菌Rosetta gami B,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测分析表明,PoIFN-λ3基因获得表达,重组蛋白大小为32 000,以包涵体形式存在。重组蛋白经变性、纯化、复性后,用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性的测定。结果显示,复性后重组蛋白的含量约为1g/L,抗水泡性口炎病毒(VSV)活性达到2×103 U/mg,表明重组poIFN-λ3具有较高的抗病毒作用。; 周恒沈海燕郭鹏举张春红张建峰刘志成孙俊颖李玉谷; 关键词：原核表达抗病毒活性

鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立被引量：4: 2017年; 参考Gen Bank上已发表的产蛋下降综合征病毒(EDSV)五邻体(penton)基因序列、H9亚型禽流感病毒的HA基因和鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因序列,分别设计了检测EDSV、H9 AIV和DTMUV的特异性引物,扩增目的片段大小分别为110bp、281bp和266bp。通过PCR验证及引物浓度的优化,建立了针对这3种病毒的三重荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV,且不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应;敏感性试验表明,该方法对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8.0、4.8和1.3个拷贝,该方法比常规PCR方法敏感10倍;该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。通过标准曲线的建立以及临床样品的检测表明,该方法可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量检测。; 孙敏华李林林董嘉文刘志成孙俊颖沈海燕张建峰张春红

p53基因RNA干扰载体的构建及其在ST细胞系中的稳定表达: 2016年; 利用质粒介导的RNA干扰技术,建立稳定沉默p53基因的ST细胞系。通过改造p EGFP-C1载体,构建了猪源U6启动子启动编码p53 sh RNA序列的载体,将其转染ST细胞,用G418筛选细胞,并分析获得细胞的生长特性。RT-PCR和Western-blot结果显示,质粒介导的sh RNA有效地沉默了p53基因的表达;流式细胞术和细胞生长特性分析结果显示,与对照组细胞相比,p53基因沉默组ST细胞处于S期的细胞数量增多,而且p53基因沉默组ST细胞生长较快。本研究结果证实质粒介导的sh RNA高效、稳定地沉默了ST细胞中p53基因的表达。; 沈海燕张春红刘志成孙俊颖卢宇张建峰; 关键词：P53基因 RNA干扰细胞系

家禽视黄酸诱导基因-Ⅰ研究进展被引量：1: 2015年; 天然免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线,视黄酸诱导基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)是细胞质内识别病毒双链RNA的一类模式识别受体,能够识别细胞质中的病毒RNA,诱导宿主细胞产生Ⅰ型干扰素等细胞因子,进而产生相应的抗病毒天然免疫反应。目前对人、小鼠、猪等哺乳动物细胞中RIG-Ⅰ介导的抗病毒天然免疫反应的研究较为深入,对家禽RIG-Ⅰ的相关研究还处于起步阶段。近年来,鸭和鹅的RIG-Ⅰ相继被研究。鸭和鹅RIG-Ⅰ的发现、结构特点、组织表达及其抗流感病毒和其他禽类病毒作用方面的研究都有了新的进展,将为禽类抗病毒和免疫系统研究提供参考。; 李林林董嘉文孙敏华袁建丰邝瑞欢刘志成张春红; 关键词：天然免疫抗病毒

鸡贫血病毒广州株VP3和VP1基因的克隆与序列分析: 2015年; 采用PCR方法成功克隆了3株鸡贫血病病毒（CAr）广州株VP3和VPl的部分基因，并进行了核苷酸序列测定。序列分析表明，3株CAV广州株与国内外其他21株CAV毒株的核苷酸序列相似性在89．5％-100．0％之间；推导氨基酸序列的相似性在84．8％-98．2％之间。系统发育进化树分析显示，3株CAV广州株和中国TJBD40、SD22、SD24株都同处于一个分支上，而与马来西亚的SMSC-1株、日本的G6株以及澳大利亚的CAU269／7株的亲缘关系较远。; 沈海燕张建峰刘志成周恒郭翠丽郭鹏举张春红; 关键词：鸡贫血病病毒分子进化树

鸡毒支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立被引量：5: 2015年; 为建立鸡毒支原体(MG)的快速定量检测方法,本研究根据GenBank中登录的MG 16S rDNA基因序列设计了一对引物,以MG基因组DNA为模板扩增其16S rDNA基因片段,并克隆于pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒作为标准品建立了MG SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法在1.96×10~8拷贝/μL^1.96×10~2拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限可达1.96×10~1拷贝/μL;与禽类其它呼吸道病原无交叉反应,特异性良好;批内及批间变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。采用该方法抽检30份疑似临床样品,检出率为40%,敏感性明显高于常规PCR(33%)和血清平板凝集试验方法(23%),检测活疫苗可达到精确定量每头份2.0×10~7拷贝/μL。该研究为MG的早期诊断与净化、疫苗质量监测提供了一种新的快速定量检测技术。; 孙俊颖刘志成孙敏华李冰玲沈海燕张春红董嘉文李林林张建峰; 关键词：鸡毒支原体 SYBR 荧光定量PCR

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刘志成

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