姜清波
- 作品数:2 被引量:2H指数:1
- 供职机构:清华大学生命科学学院更多>>
- 发文基金:国家自然科学基金更多>>
- 相关领域:生物学医药卫生更多>>
- 双亮氨酸模体对NOK/STYK1蛋白的表达及细胞内分布特征的影响被引量:2
- 2015年
- NOK(novel oncogene with kinase domain)蛋白是一种新的在结构上比较独特的受体型酪氨酸蛋白激酶家族(protein tyrosine kinases,PTKs)成员,具有较强的促肿瘤形成及转移的能力,并参与细胞的内吞过程。基因结构序列分析结果表明,在NOK氨基酸序列中存在多处双亮氨酸模体(di-leucine motif)。有研究表明,双亮氨酸模体在细胞的内吞、膜泡运输以及细胞信号分拣等过程中具有重要作用。为此,该研究构建了一系列NOK蛋白双亮氨酸模体突变体,并在He La细胞中分析了其蛋白质表达水平及细胞内分布特征。结果表明,NOK蛋白的不同双亮氨酸模体的突变可导致NOK蛋白在细胞中表达量的改变。与对照相比,NOKL220P表达量明显提高,而NOKL237P表达量降低。从NOK蛋白在细胞内的分布特征来看,不同双亮氨酸模体的突变同样会引起NOK蛋白在细胞内分布的改变,包括NOK蛋白形成聚集体的细胞比例、在细胞中的分布位置以及聚集体的大小和数量的不同。特别是NOKL203P、NOK237P以及L299P三个位置的突变可以显著地降低NOK蛋白在细胞中的聚集。不仅如此,过量表达NOKL41P还表现出了更为明显的核膜定位特征,而L220P则表现出了更为明显的质膜定位特征。由此说明,NOK的不同双亮氨酸模体对其蛋白质表达水平以及在细胞内的定位分布具有重要的调节作用,该研究为阐明NOK蛋白促肿瘤形成及转移的分子机理提供了新的见解。
- 胡丹姜清波颜廷越张淑平
- 关键词:突变体
- 蛋白酪氨酸激酶NOK/STYK1胞内区的表达与纯化
- 2014年
- 目的:酪氨酸蛋白激酶NOK/STYK1具有很强的促肿瘤形成和转移能力,被认为是很有前途的肿瘤治疗靶点。由于NOK含有一个跨膜区,且富含疏水性氨基酸,其表达和纯化非常困难,直接影响了对其功能及相关分子机理的深入研究。本研究目的是获得可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白△NOK(AA:49-422),为后续抗体的制备和功能研究奠定重要基础。方法:含有△NOK基因的原核表达载体,转入E.coli BL21中,IPTG诱导蛋白表达,通过亲和层析获得可溶的△NOK融合蛋白。融合蛋白经凝血酶酶切后,凝胶过滤层析分离标签蛋白获得△NOK蛋白。同时,我们还通过Bac-to-Bac系统获得含有△NOK基因的杆状病毒,感染sf9细胞,尝试在真核细胞中表达目的蛋白。结果:通过在sf9昆虫细胞和大肠杆菌表达系统中盐浓度等各种条件的摸索,首次获得了可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白(△NOK-GST)和一定量去除标签的△NOK蛋白。本研究中与大肠杆菌相比,昆虫细胞并不适合△NOK的纯化。结论:我们建立了一套优化的NOK蛋白表达和纯化体系,从而为后续抗体制备和各种体内外生化实验等功能研究奠定基础,为研究NOK在肿瘤中的作用和药物筛选创造条件。同时丰富了整个RTKs家族作用机制的探索,进一步促进了以RTKs为靶点的治疗手段在临床上的应用。
- 李蕊王琛吴放姜清波丁雪张淑平
- 关键词:凝胶过滤层析