孙芳
- 作品数：10 被引量：13H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 波动高糖激活蛋白激酶C-β2加重内皮细胞损伤及二甲双胍的作用
- 目的 观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞粘附分子1(VCAM-1)mRNA表达及活性氧(ROS)水平的影响,探讨PKC-β2在其中的作用及二甲双胍的干预影响...
- 周波林雪波孙芳
- 蛋白激酶Cδ在高糖致人脐静脉内皮细胞周期阻滞和凋亡中的作用及机制被引量：2
- 2009年
- 目的探讨蛋白激酶C(PKC)δ在高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)周期阻滞和凋亡中的作用及机制。方法实验按以下分组方式处理细胞:正常葡萄糖对照组(NG,D-葡萄糖5.6mmol/L),Ad5-null转染+正常葡萄糖培养组(NN,D-葡萄糖5.6mmol/L),高糖培养组(HG,D-葡萄糖25mmol/L),Ad5-PKCδ转染+高糖培养组(PHG,D-葡萄糖25mmol/L),Ad5-PKCδ转染+高糖+PKCδ抑制剂Rottlerin处理组(PHR,10μmol/LRottlerin)。激光共聚焦显微镜下观察高糖刺激的PKCδ表达变化,流式细胞技术检测各组细胞周期分布、凋亡率。免疫印迹检测磷酸化叉头蛋白O1(p-FOXO1)(S256)及P27kip1蛋白表达水平。结果与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P>0.05)。与NG组比较,HG组PKCδ在HUVECs内的表达显著增加,细胞质与细胞核荧光比值下降,细胞G0/G1期阻滞增加,凋亡率上升,p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平升高(P<0.05)。与HG比较,PHG组过表达PKCδ后,细胞质与细胞核荧光比值明显下降(P<0.05),G0/G1期阻滞增加,凋亡率上升(P<0.05),p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平进一步升高(P<0.05)。与PHG组比较,PHR组特异性抑制PKCδ活性后,细胞质与细胞核荧光比值增加(P<0.05),细胞周期阻滞及凋亡改善,p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平降低(P<0.05)。结论高糖负荷可使HUVECs中PKCδ表达增加并发生核转位激活,导致p-FOXO1(S256)及P27kip1蛋白水平升高,使细胞阻滞于G0/G1期并发生凋亡。
- 孙芳周波林雪波陈芳芳
- 关键词：脐静脉内皮细胞葡萄糖细胞周期阻滞
- 高糖应激致人PRKCD基因过表达内皮细胞模型构建及鉴定
- 2010年
- 目的:构建高糖应激下人PRKCD基因过表达内皮细胞模型并鉴定。方法:设计含AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的PRKCD基因上下游引物,以含PRKCD基因的原始质粒为模版,PCR扩增获得PRKCD全部序列,经AgeⅠ和NheⅠ酶切后与同样酶切后的真核表达载体pDC316-LacZα重组获得穿梭质粒pDC316-PRKCD,经PCR及酶切、基因测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pB-HGlox△E1,3Cre共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-PRKCD,行PCR鉴定并反复纯化扩增后用TCID50法测定病毒滴度。分组培养人脐静脉内皮细胞,转染重组腺病毒后于高糖(25mmol/L)负荷,并设立空载体对照及渗透压对照组,以免疫荧光法检测PKCδ在细胞中的表达。结果:目的基因成功插入穿梭质粒,基因测序结果与GenBank公布序列一致,重组腺病毒Ad5-PRKCD经PCR鉴定及免疫荧光鉴定成功。测得病毒滴度为1.0×1010IU/ml。激光共焦聚观察高糖负荷下,胞内PRKCD翻译产物PKCδ荧光表达强度明显增强,为正常对照组的1.5倍(P<0.05),高糖负荷下内皮细胞感染重组腺病毒后PKCδ荧光强度明显增加,浆/核荧光强度比值较高糖组进一步降低了35%(p<0.05),提示核转位明显。结论:成功构建了人重组腺病毒Ad5-PRKCD并有效转染人脐静脉内皮细胞,高糖负荷使PKCδ表达上调并发生核转位激活,为筛选稳定表达PKCδ的内皮细胞株及其蛋白复合体奠定了基础。
- 孙芳周波林雪波段炼李启富
- 关键词：高葡萄糖核转位人脐静脉内皮细胞
- 蛋白激酶Cβ2通过调控PPARα介导高糖诱导的人内皮细胞损伤被引量：3
- 2010年
- 目的研究蛋白激酶C（PKC）β2、PPARα在高糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达血管内皮生长因子（VEGF）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）mRNA中的作用及相互关系。方法将培养的HUVECs分为以下8组：正常糖（NG，5mmol／L D-葡萄糖）组、高糖（HG，25mmol／L D-葡萄糖）组、渗透压对照（L，NG＋20mmol／L L-葡萄糖）组、正常糖空载体转染（NN，NG＋Ad5-null）组、高糖PKCβ2转染（HB，HG＋AdS—PKCβ2）组、高糖＋非诺贝特（HF，HG＋40umol／L非诺贝特）组、高糖PKCβ2转染＋非诺贝特（HBF，HB＋40umol／L非诺贝特）组，另以非诺贝特共孵育20min作为HF20组，以上各组细胞均培养6d。以RT-PCR检测VEGF、VCAM-1mRNA的表达水平，用Western印迹法测定PPARα蛋白表达，采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白的表达和转位。结果（1）HG组VEGF、VCAM—1mRNA表达增加，分别为NG组的1．91倍和1．56倍（均P〈0．05）；HB组VEGF、VCAM-1mRNA表达较HG组进一步增加，分别为NG组的2．59倍和2．07倍（均P〈0．05）。HF组VEGF、VCAM-1mRNA表达则明显下调，分别为HG组的68％和74％（均P〈0．05）；与HG组相比，HF20组VEGF、VCAM-1mRNA表达差异无统计学意义。（2）HG组PPARα蛋白表达较NG组减少了20％，HB组PPARα蛋白水平进一步下降，为HG组的78％，与HG组相比，HF组PPARα蛋白水平上调了13％（P〈0．05）。（3）HG诱导PKCβ2核转位激活，定量分析示HG组浆／核荧光强度比值较NG组降低37％（P〈0．05），HB组PKCβ2核转位与HG组相比更加明显。结论高糖通过诱导HUVECsPKCβ2核转位，进而调控PPARα表达，增加VEGF、VCAM-1mRNA的表达。
- 林雪波周波孙芳陈芳芳李启富邓华聪
- 关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体Α人脐静脉内皮细胞视网膜
- 罗格列酮改善肥胖大鼠心肌缺血再灌注后心功能及糖代谢
- 2009年
- 背景虽然临床研究罗格列酮对心肌梗死的发生率有负面影响,但仍有不少报道认为该药对肥胖心肌对缺血易损性反应及机制有良好作用。目的观察罗格列酮治疗减轻肥胖大鼠心肌缺血/再灌注(MI/R)后损伤及其糖代谢改善机制。方法Wistar大鼠通过高脂喂养建立肥胖模型,随机分为肥胖组(n=12)和罗格列酮组[罗格列酮灌胃,3 mg/(kg.d),n=12]2周,喂养普通饲料Wistar大鼠为对照组(n=12)。行正葡萄糖-高胰岛素钳夹试验和腹腔葡萄糖耐量试验。结扎冠脉40 min后放开,再灌注2 h,制备MI/R模型,记录心脏血流动力学参数。检测缺血区和梗死区,用TUNEL分析心肌细胞凋亡。免疫印迹检测蛋白激酶B(PKB/Akt)和葡萄糖转运子4(GluT4)在心肌中的表达。结果肥胖组血浆和心肌三酰甘油、游离脂肪酸(FFA)和空腹胰岛素(FINS)水平均高于对照组,葡萄糖输注率(GIR)为对照组的34%。罗格列酮降低心肌三酰甘油、FFA、FINS,提高GIR 130%。与对照组相比,肥胖组MI/R后心功能恢复差,梗死区域扩大(82%),心肌细胞凋亡增加70%,伴细胞PKB/Akt和GluT4表达减少。与肥胖组比较,罗格列酮改善MI/R的恢复,梗死区域缩小(30%),细胞凋亡较肥胖组减少27%,PKB/Akt和GluT4表达增加。结论肥胖大鼠心肌MI/R易损性增加,PKB-GluT4信号转导途径下调,心肌细胞凋亡,心功能恶化。罗格列酮可通过改善胰岛素信号通路减少心肌MI/R损伤。
- 周波孙芳毛锦宁吴豪杰陈运贞张素华
- 关键词：肥胖心功能罗格列酮
- 蛋白激酶Cβ2-活性氧交互环介导高糖致内皮细胞损伤记忆效应被引量：5
- 2010年
- 目的以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为体外模拟高血糖记忆的研究对象，观察蛋白激酶C（PKC）β2、活性氧（ROS）对其表达血管内皮生长因子（VEGF）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）mRNA的影响，并探讨PKCβ2、ROS在其中可能的交互作用。方法将培养的HUVECs分为以下5组：正常糖（NG，5mmol／LD-葡萄糖×3周）组、高糖（HG，25mmol／LD-葡萄糖×3周）组、记忆（M，25mmol／LD-葡萄糖×2周＋5mmol／LD-葡萄糖×1周）组、记忆PKCp，转染[MB，25mmol／LD-葡萄糖×2周＋5mmol／LD．葡萄糖×1周＋PKCp2重组腺病毒（Ad5-PKC[32）]组、记忆＋Ot-硫辛酸（MA，25mmol／LD-葡萄糖×2周＋5mmol／LD-葡萄糖×1周＋62．5μmol／LOt-硫辛酸）组。以RT—PCR法检测VEGF、VCAM．1mRNA表达水平，用荧光显微镜和荧光酶标仪测定ROS水平，采用激光共聚焦检测PKCβ2蛋白的表达和转位。结果（1）HG组和M组VEGF、VCAM-1mRNA表达增加，分别为NG组的1．76倍、1．35倍和1．69倍、1．43倍（P值均〈0．05）。（2）HG组和M组ROS水平分别较NG组升高了86％、80％（P值均〈0．05）；MA组ROS水平较M组下降了38％，同时MA组VEGF、VCAM-1mRNA表达亦较M组显著下调，分别为M组的67％、78％（P值均〈0．05）。（3）HG组和M组PKCβ2核转位激活，定量分析显示，胞质／胞核荧光强度比值均较NG组下降，分别为NG组的70％、74％（P值均〈0．05）；MB组PKCβ2核转位较M组更为明显，胞质／胞核荧光强度比值为M组的77％，同时MB组VEGF、VCAM-1mRNA表达亦较M组进G 步上调，分别为M组的1．29倍、1．18倍（P值均〈0．05）。（4）MA组PKCβ2核转位较M组减少，胞质／胞核荧光强度比值为M组的1．18倍；而MB组ROS水平较M组上调了25％（P值均〈0．05）。结论HUVECs存在高糖记忆效应，PKCβ2-ROS交互环可能介导了这个效应的发生。
- 林雪波周波孙芳陈芳芳
- 关键词：蛋白激酶C活性氧内皮细胞代谢记忆
- 高糖诱导人内皮细胞PKC-delta相关核蛋白组学研究
- 孙芳周波林雪波陈芳芳
- 代谢性胰岛素抵抗对肥胖大鼠心肌缺血/再灌注耐受性的影响被引量：1
- 2012年
- 目的探讨代谢性胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)对肥胖大鼠心肌缺血/再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)耐受性的影响。方法将Wistar大鼠随机分为对照组(Cont组)、罗格列酮组(Rosi组)和肥胖组(Obes组),Rosi组给予高脂饲料喂养的同时灌胃罗格列酮,Obes组给予高脂饲料喂养,并灌胃相同剂量的生理盐水。检测各组大鼠血浆中各项生化指标、心肌组织总甘油三酯(Triglyceride,TG)的含量及胰岛素敏感性。制备大鼠MI/R模型,并取Obes组和Rosi组大鼠,输注磷脂酰肌醇-3羟基激酶(PI3K)抑制剂渥曼青霉素,分别记为Obwt组和Wort组,检测各组大鼠心脏血流动力学指标的变化;伊文蓝染色测定大鼠心肌缺血面积,2,3,5一氯化三苯四氮唑(TTC)染色测定心肌梗死面积;原位末端标记凋亡细胞(TUNEL)法分析心肌细胞凋亡;Western blot法检测心肌中PKB/Akt和GluT-4蛋白的表达水平。结果 MI/R前,与Cont组相比,Obes组大鼠心肌TG及血浆中游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)、TG和空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),葡萄糖输注率(Glucose infusion rate,GIR)显著降低(P<0.01);而Rosi组大鼠血浆中TG、FFA和FINS水平较Obes组显著降低(P<0.01),GIR显著升高(P<0.01)。与Cont组相比,Obes组大鼠MI/R后,心功能恢复差,梗死面积扩大,心肌细胞凋亡增多,并伴PKB/Akt和GluT-4表达水平下降;Rosi组与Obes组比,MI/R恢复能力增强,梗死面积缩小,细胞凋亡减少,PKB/Akt和GluT-4表达水平增加。Wort组大鼠可逆转Rosi组的抗凋亡作用,下调PKB/Akt和GluT-4的表达水平;而Obwt组大鼠MI/R后,心功能、心肌细胞凋亡数及PKB/Akt和GluT-4表达水平与Obes组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论肥胖大鼠心肌IR增加了MI/R时的易损性,与PI3K-PKB-GluT-4信号通路下调、心肌细胞凋亡增加及心功能恶化密切相关。
- 段雅倩周波孙芳毛锦宁吴豪杰陈运贞张素华
- 关键词：肥胖胰岛素抵抗
- 二甲双胍下调ROS-PKCβ_2通路对高糖波动加重的人内皮细胞损伤的干预作用被引量：2
- 2011年
- 目的观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA表达的影响,探讨活性氧(ROS)和蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)在其中的作用及二甲双胍的干预作用。方法将培养的HUVECs分为7组:①正常糖(NG,5mmol/L D-葡萄糖)组,②正常糖空载体转染组(NN,NG+Ad5-null)组,③持续性高糖(SHG,15mmol/L D-葡萄糖)组,④波动性高糖(I HG,5mmol/L D-葡萄糖与25mmol/L D-葡萄糖每24h更换一次)组,⑤波动性高糖+PKCβ2转染(I HGB,I HG+Ad5-PKCβ2)组,⑥波动性高糖+二甲双胍(I HGM,I HG+20μmol/L二甲双胍)组,⑦波动性高糖+选择性的PKCβ2抑制剂CGP53353(I HGI,I HG+10μmol/L CGP53353)组或波动高糖+α-硫辛酸(ALA)(I HGA,I HG+62.5μmol/L ALA)组。RT-PCR法检测细胞VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,荧光酶标仪测定细胞ROS水平,激光共聚焦显微镜下检测PKCβ2蛋白表达和转位情况。结果与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P>0.05)。SHG组和I HG组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平增加,分别为NG组的2.16倍、2.30倍、1.75倍和2.57倍、3.32倍、3.20倍,且I HG组增加更明显(P<0.05)。SHG组和I HG组PKCβ2核转位激活,定量分析显示胞质/胞核荧光强度比值较NG组分别下降了21%和26%,且I HG组下降更加明显(P<0.05);I HGB组PKCβ2核转位较I HG组更显著,胞质/胞核荧光强度比值为I HG组的75%,同时I HGB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达以及ROS水平亦显著增高,分别为I HG组的1.38倍、1.45倍和1.25倍(P<0.05)。I HGM组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平均较I HG组明显降低,为I HG组的44%、53%和39%;I HGM组PKCβ2核转位亦较I HG组减少,胞质/胞核荧光强度比值为I HG组的1.20倍(P<0.05)。结论波动高糖较持续高糖更易损伤HUVECs,该作用与ROS-PKCβ2活化密切相关;二甲双胍可通过抑制PKCβ2激活,减轻波动性高糖诱导的HUVECs损伤。
- 陈芳芳周波林雪波段雅倩孙芳
- 关键词：氧化性应激脐静脉内皮细胞二甲双胍
- PKC-delta在高糖致HUVECs周期阻滞和凋亡中的作用机制
- 孙芳周波林雪波陈芳芳
