李冬冬
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 供职机构：第四军医大学西京医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 无标签人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测
- 2013年
- 目的:利用基因工程方法构建无标签人源性脂联素球状结构(gAd)基因的原核表达载体,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化及鉴定。方法:从正常人脂肪组织里提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经低温、低浓度IPTG诱导使其可溶性表达,采用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析三步分离纯化,得到不带任何标签的人源性gAd;运用SDS-PAGE、Western印迹、HPLC对重组蛋白进行鉴定,通过对AMP激活的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平检测纯化蛋白的生物学活性。结果:构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的可溶性表达,纯化的蛋白经SDS-PAGE和Western印迹分析证实为gAd,HPLC分析蛋白纯度达到95%以上;通过对AMPK磷酸化水平的检测,证明纯化的gAd具有高生物学活性。结论:重组表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构,为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础。
- 张立剑孙璐李冬冬郭云萍王增禄刘毅张英起陶凌
- 关键词：表达纯化活性检测
- 重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测
- 2013年
- 目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测。方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd。运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性。结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性。结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础。
- 张立剑孙璐郭云萍李冬冬王增禄刘毅张英起陶凌
- 关键词：表达纯化心脏保护
- 脂联素通过APPL1减轻缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡被引量：5
- 2012年
- 目的:探讨APPL1在脂联素(adiponectin,ANP)拮抗SD乳鼠心肌细胞(neonatal cardiomyocytes)缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用。方法:分离SD乳鼠心肌细胞并培养。通过对培养的心肌细胞H/R损伤模拟缺血/再灌注(simulated ischemia reperfusion,SI/R)后,随机分为对照组、H/R组、H/R+APN组及H/R+APN+APPL1 RNAi组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞的生存率,原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡,Westernblot检测APPL1蛋白的表达。结果:与对照组相比,H/R组吸光度值明显降低(P<0.01),凋亡指数(AI)显著上升(P<0.01)。与对照组和H/R组相比,H/R+APN组中APPL1的表达明显上升(P<0.05)。以RNAi抑制APPL1表达后,与H/R+APN组相比,H/R+APN+APPL1 RNAi组凋亡指数率(%)明显上升[(28.32±4.13)%vs.(9.78±2.16)%,P<0.01]。结论:APN可显著抑制H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡,促进心肌细胞存活,其拮抗作用与上调APPL1蛋白的表达相关。
- 李冬冬张海锋孙璐张荣庆王海昌陶凌
- 关键词：脂联素心肌细胞乳鼠
