采用巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/p PIC9KG6进行高密度发酵,获得细胞外分泌型重组人源胶原蛋白(recombinant human-source collagen,RHSC)。SDS-PAGE电泳分析证明:RHSC具有确定的分子质量,分别约为56 k Da的蛋白单体与112 k Da的二聚体。实验中运用透析法、盐析与柱层析结合法对工程菌的发酵上清液进行纯化,结果如下:(1)透析法——最佳条件为4℃,透析24 h,RHSC单体与二聚体混合物回收率接近100%,纯度82.5%。(2)盐析-柱层析结合法——发酵上清液通过40%饱和度硫酸铵沉淀与Sephadex G100纯化后获得二聚体,达到了电泳纯。通过DSC、紫外光谱、红外光谱与核磁共振波谱对分离纯化得到的RHSC进行结构表征,与标准Ⅲ型胶原蛋白比对,确定RHSC具有Ⅲ型胶原蛋白的特征结构。
