曹唯希
- 作品数：40 被引量：102H指数：5
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金重庆市科委基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- Skp2反义寡核苷酸对K562细胞生长和增殖的影响被引量：11
- 2003年
- 背景与目的:泛素-蛋白酶体途径是真核细胞中选择性降解短寿命蛋白的重要途径。S期激酶相关蛋白2(S-phasekinase-associatedprotein2,Skp2)是此途径中的一个重要组件,它是决定细胞周期素依赖性激酶抑制因子p27降解的关键蛋白。近年来,在实体瘤的研究中发现Skp2是癌蛋白,能促进癌细胞的细胞周期进展,但在白血病细胞恶性增殖中所起的作用还未见报道。本实验旨在研究Skp2反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)对白血病细胞系K562细胞生长和增殖的影响及其可能的机制。方法:Skp2反义寡核苷酸和K562细胞共同培养,通过显微镜下观察、四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察K562细胞生长和增殖,流式细胞术分析细胞周期,逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)和细胞免疫化学测定Skp2mRNA、蛋白及p27mRNA、蛋白的表达。结果:Skp2反义寡核苷酸处理后,K562细胞增殖受抑,细胞周期阻滞于G0/G1期犤Skp2ASODN组(39.7±9.1)%,对照组(31.5±7.3)%,P<0.05犦。Skp2mRNA及Skp2蛋白水平降低;尽管p27mRNA未见改变,但其蛋白水平明显升高。结论:Skp2反义寡核苷酸能抑制K562细胞增殖,这种抑制作用主要是通过调控泛素-蛋白酶体途径,进而影响细胞周期进展而实现的。
- 王小中冯文莉刘兴曹唯希黄宗干
- 关键词：SKP2反义寡核苷酸K562细胞生长S期激酶相关蛋白2慢性粒细胞白血病
- 新鲜羊膜致I型超敏反应的变应原性研究被引量：2
- 2006年
- 研究新鲜人羊膜的变应原性及其致敏后发生I型超敏反应的可能性。建立豚鼠全身主动过敏实验模型。分新鲜羊膜组、新鲜蛋清组(阳性对照)和PBS液组(阴性对照),每组10只豚鼠。观察豚鼠在致敏期和激发后的反应,采用化学荧光法检测外周血组胺含量,血液流变分析系统检测4项血液流变学指标(全血高切变率黏度、全血低切变率黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数)。致敏期间各组豚鼠的体重变化无明显差别(P>0.05);激发后羊膜组豚鼠与阴性组表现一致,无异常反应;羊膜组外周血组胺含量及4项血液流变学指标均与阴性对照无明显差别(P>0.05),与阳性对照有显著性差异(P<0.01)。经规范化无菌处理后的新鲜羊膜,一般不具有变应原性,不会引起I型超敏反应。
- 赵敏张琪曹唯希滕永真张晓萍胡柯鲁静秦应祥
- 关键词：人羊膜变应原
- 携SH2-Caspase8融合基因重组腺病毒的构建及对K562细胞增殖的影响被引量：2
- 2011年
- 目的构建并鉴定携SH2-Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法采用RT-PCR、重叠PCR扩增SH2-Caspase8融合基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-SC-EGFP,进行酶切和测序鉴定。将PmeⅠ酶切后的穿梭质粒转化pAdEasy-BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAdE-SC-EGFP及其突变体,PacⅠ酶切后将其转染AD293细胞进行包装,PCR和Western blot鉴定重组腺病毒AdE-SC-EGFP,验证后扩增病毒并测定滴度。结果 PCR检测、酶切和测序结果均表明腺病毒穿梭质粒pAdT-SC-EGFP和重组腺病毒质粒pAdE-SC-EGFP构建成功;PCR检测、EGFP表达检测结果证明重组腺病毒AdE-SC-EGFP包装成功,扩增后,滴度可达1.5×1012pfu/ml。感染K562细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达,MTT和半固体集落形成实验检测其对K562细胞生长增殖的影响。结论成功构建并鉴定了携带SH2-Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体;MTT和克隆形成实验证明重组腺病毒AdE-SC-EGFP对BCR-ABL阳性的K562细胞有明显的增殖抑制作用。
- 刘双凤胡晶曹唯希史静彭智王海霞李亚娟冯文莉
- 关键词：细胞增殖SH2CASPASE8重组腺病毒K562细胞BCR-ABL
- 靶向激活蛋白激酶PKR诱导白血病K562细胞凋亡被引量：2
- 2009年
- 目的:采用双链RNA能激活细胞内蛋白激酶PKR引起细胞凋亡的策略,研究重组慢性粒细胞白血病独特的bcr/ablb3a2型外源反义RNA诱导白血病K562细胞的凋亡及其作用机制。方法:用含bcr/abl融合基因序列40bp的反转录病毒载体RV-40AS作用于白血病K562细胞,以光学显微镜、电子显微镜、FCM法和DNA梯状条带法检测细胞凋亡情况,化学比色法检测caspase-8和caspase-9活性变化,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2 mRNA表达变化,并以Western印迹法检测双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)、磷酸化PKR(p-PKR)、Bax和Bcl-2的蛋白变化。结果:RV-40AS作用K562细胞组在光学显微镜下出现胞体皱缩、染色质浓集以及折光性减弱,电子显微镜下可见细胞质电子密度增大、核固缩和出现凋亡小体;FCM法检测到凋亡细胞占(22.70±1.42)%[未处理组(3.24±0.66)%],DNA电泳出现典型的梯状条带;caspase-8和caspase-9活性升高,PKR蛋白无明显变化,但p-PKR水平升高;Bax的mRNA和蛋白表达均升高,而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平没有明显变化。对照组和PKR抑制剂处理组均未发生上述改变。结论:bcr/abl反义RNA反转录病毒载体RV-40AS可特异性激活PKR,从而诱导白血病K562细胞发生凋亡,其可能的机制是PKR活化激活了凋亡反应的上游分子caspase-8,并通过上调Bax表达水平、降低Bcl-2/Bax的比值,导致线粒体膜稳定性被破坏,促使凋亡小体形成和caspase-9活化,最终激活其他凋亡分子使细胞发生凋亡。
- 白卫君王小中曾建明赵世巧温健萍肖青曹唯希黄宗干冯文莉
- 关键词：白血病蛋白激酶类细胞凋亡K562细胞
- 自身淬灭荧光定量PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA
- 2007年
- 目的利用自身淬灭探针技术建立一种能检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr／abl融合基因mRNA的实时荧光定量PCR方法，为CML的诊断、疗效观察以及微量残留白血病（MRD）的监测提供有效手段。方法用逆转录PCR方法（RT—PCR）扩增K562细胞的bcr／abl融合基因，A-T克隆法构建定量标准模板；设计自身淬灭荧光引物（探针），建立自身淬灭荧光定量逆转录PCR方法（FQ—RT—PCR），并对该方法的线性检测范围、灵敏度、重复性、稳定性进行检测；然后检测临床白血病患者骨髓标本bcr／abl mRNA。结果建立的FQ—RT—PCR方法可检测10copies／μl的bcr／abl重组质粒，并能从10^5个正常细胞中检出1个白血病细胞，该方法的批内、批间变异系数（CV）分别为2．1％、6．1％，线性检测范围为10^2-10^9copies／μl。25例CML患者bcr／abl融合基因mRNA表达量中位数为4．50×10^4[（0．45—89．00）×10^4]copies／μg RNA，其中11例慢性期初诊患者bcr／abl mRNA表达量中位数为5．45×10^4[（2．95—19．30）×10^4]copies／μg RNA，6例急变期患者bcr／abl mRNA表达量中位数为13．00×10^4[（4．10～89．00）×10^4]copies／μg RNA，8例慢性期治疗后复查患者bcr／abl mRNA表达量中位数为2．35×10^4[（0．45—5．12）×10^4]copies／μg RNA，CML急变期患者bcr／abl融合基因表达水平与慢性期患者之间差异有统计学意义（q=3．41，P〈0．05）。PCR产物经电泳分析，其中21例CML患者为b3a2型，4例CML患者为b2a2型；3例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中，1例有bcr／abl mRNA表达，为b2a2型。结论所建立的基于自身淬灭探针技术的实时荧光定量PCR检测方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于标准统一。可广泛用于CML的诊断、疗效观察以及MRD的监测。
- 彭辉冯文莉王小中曾建明肖青潘健曹唯希罗云萍黄宗干
- 关键词：聚合酶链反应BCR/ABL融合基因
- bcr-abl反转录病毒介导的慢性粒细胞白血病样小鼠二次移植模型的建立被引量：1
- 2009年
- 目的:构建bcr-abl反转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)样二次移植模型,为深入研究CML的发病和治疗机制奠定可靠的基础。方法:收集已成功建模的由bcr-abl反转录病毒介导的CML样模型小鼠的骨髓细胞或脾细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量γ射线(450 cGy)照射的同种雌性受体鼠,进行造血组织的形态学观察、Y染色体及其特异性性别决定基因Sry的检测以及bcr-abl mRNA和蛋白水平表达的检测,分析鉴定CML样小鼠二次移植模型情况。结果:移植后12 d,肉眼可见明显的脾结节形成,连续切片可见成堆脾集落。移植4~5周后,在雌性受体小鼠骨髓中检出相似Y染色体及Y染色体特异性Sry基因,骨髓和脾脏中检出bcr-abl融合基因。移植10~12周后外周血白细胞水平升高至正常未处理小鼠的4~8倍,粒系细胞水平明显升高至(20~32)×109个/L,外周血涂片幼稚细胞占10%~20%;骨髓涂片结果显示粒系细胞显著增多,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;同时,在肝脏中检测出bcr-abl融合基因,骨髓中检测出bcr-abl融合蛋白的表达。移植18周后,外周血涂片幼稚细胞占30%以上,小鼠发生急性变,最终因肺出血相继死亡。结论:本研究成功建立了bcr-abl反转录病毒介导的小鼠CML样二次移植模型,该模型可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究。
- 张文萍黄世峰袁颖王雅珍温健萍曹唯希黄宗干冯文莉
- 关键词：融合蛋白质类异种移植模型抗肿瘤试验小鼠近交BALB/C
- 重组蛋白转导域-寡聚化域-血凝素融合蛋白抑制慢性粒细胞白血病BaF3-P210细胞小鼠致瘤能力
- 2011年
- 目的:探讨重组蛋白转导域-寡聚化域-血凝素(protein transduction domain-oligomerization domain-hemagglutinin,PTD-OD-HA)对慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)BaF3-P210细胞小鼠致瘤能力的影响。方法:将BaF3-P210细胞和经40μmol/L PTD-OD-HA处理48h的BaF3-P210细胞分别经尾静脉注射入BALB/c小鼠体内,观察小鼠一般状况以及生存时间,计数外周血白细胞,外周血和骨髓涂片进行Wright-Giemsa染色,肝、脾和肺等各主要脏器组织进行HE染色,蛋白质印迹法检测小鼠骨髓细胞bcr/abl蛋白的表达。结果:BaF3-P210细胞组和经PTD-OD-HA处理的BaF3-P210细胞组小鼠CML发病率分别为90%(9/10)和80%(8/10),外周血白细胞计数分别为(44.3±4.8)×109/L和(20.6±3.2)×109/L(P<0.05),骨髓细胞中bcr/abl癌蛋白表达量分别为5.13±0.46和1.32±0.29(P<0.05),平均生存期分别为(101.3±6.2)d和(185.4±8.7)d(P<0.05)。Wright-Giemsa染色可见,经PTD-OD-HA处理的BaF3-P210细胞组小鼠骨髓、肝脏和脾脏中的白血病细胞浸润程度比BaF3-P210细胞组下降。结论:经PTD-OD-HA处理后的BaF3-P210细胞在BALB/c小鼠体内的致白血病潜能明显受到抑制。
- 季茂胜黄峥兰李亚娟黄世峰曾建明刘钉宾曹唯希冯文莉
- 关键词：融合蛋白质类
- 血浆纤维结合蛋白的免疫散射比浊测定法被引量：2
- 1992年
- 血浆纤维结合蛋白(Fibronectin Fn)含量测定在其方法上国内已有单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法,和酶联免疫吸附试验法.由于前两种方法的敏感性较差不适用于Fn含量较低的样品,虽然酶联免疫吸附试验敏感性较高.但由于需血浆量较多、费时、操作复杂等缺点,故我们采用免疫散射比浊法进行测定.该法利用测定溶液中悬浮质点的散射光强度的原理,因此与荧光比色法有相似之处。
- 刘国卿罗云萍曹唯希
- 关键词：血浆纤维结合蛋白免疫测定法
- 融合肽CTP-OD1和CTP-OD2对K562和K562G01细胞凋亡作用及分子机制研究
- 2013年
- 目的探讨融合肽CTP-OD1和CTP-OD2对伊马替尼(imatinib)敏感和耐药的慢性粒细胞白血病细胞株(K562、K562G01)的促凋亡生物学效应及其分子机制。方法将CTP-OD1、CTP-OD2融合肽分别处理K562和K562G01细胞,用瑞氏染色和DAPI染色检测两种细胞的凋亡形态学变化;western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及pBcr-Abl、pStat5、pCrkL变化。结果 CTP-OD1和CTP-OD2处理K562和K562G01细胞后,胞浆出现空泡,细胞核碎裂,染色质浓缩、边缘化;western blot结果表明,与阴性对照组相比,融合肽处理组Bax蛋白表达上调(P<0.05),Bcl-2、pBcr-Abl、pStat5、pCrkL蛋白均表达减少(P均<0.05)。结论 CTP-OD1和CTP-OD2通过抑制Bcr-Abl激酶活性促进imatinib敏感株K562和耐药株K562G01细胞凋亡。
- 王海霞肖恒曹唯希陶崑刘鑫李会黄世峰冯文莉
- 关键词：融合肽细胞凋亡
- 重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体的构建与鉴定被引量：10
- 2011年
- 目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HA标签的SH2基因重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体Ad5-hSH2mt-EGFP,并观察其对K562细胞增殖的影响。方法设计并化学合成引物,采用RT-PCR法扩增hSH2基因,重叠PCR法扩增hSH2mt基因,分别克隆至pAdTrack-CMV,构建穿梭质粒,经PmeⅠ酶切,转化感受态pAdEasy-BJ5183,在细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGPF和pAd5-hSH2mt-EGPF,PacⅠ酶切后转染AD293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,扩增病毒,测定滴度并经PCR和Western blot鉴定。重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测病毒对K562细胞增殖活性的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGFP和pAd5-hSH2mt-EGFP经酶切鉴定构建正确;重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP的滴度均可达1.6×1012;PCR结果表明,2种重组腺病毒包装和扩增成功,Western blot结果表明,重组腺病毒携带的目的基因能够在AD293细胞中表达;MTT检测证实,Ad5-hSH2-EGFP对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用。结论已成功构建重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,Ad5-hSH2-EGFP能在体外明显抑制K562细胞的增殖,为进一步探讨SH2基因对慢性粒细胞白血病的治疗作用及其机制奠定了基础。
- 史静彭智罗红伟曹唯希陶崑李亚娟王海霞冯文莉
- 关键词：重组腺病毒K562细胞细胞增殖
