王会娟
- 作品数：8 被引量：10H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学实验动物中心更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金重庆市卫生局医学科研项目重庆市高等教育教学改革研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 小鼠仙台病毒LAMP快速检测方法的建立被引量：1
- 2016年
- 目的:建立一种实验小鼠仙台病毒(Sendai virus,Se V)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法:采用LAMP技术,以小鼠Se V(gi:9627219)F蛋白的基因序列为靶基因,采用Primer Exploer V4软件设计LAMP的6条特异性引物,应用病毒RNA提取试剂盒提取Se V RNA,通过优化LAMP反应体系条件建立小鼠Se V特异性的LAMP检测方法(Se V/LAMP)。同时,对该方法的特异性、稳定性、重复性、灵敏度进行验证,并初步用于临床检测。结果:所建立的Se V/LAMP方法可特异性的检测出Se V RNA,其他常见病原体均为阴性。Se V/LAMP能检测出不同批次同一时间或同一批次不同时间的Se V RNA;Se V/LAMP检测Se V RNA的最低检测含量为0.33 pg,与ELISA检测方法相比较,其灵敏度高(分别为5/30和2/30)。临床检测,Se V的阳性率为27.5%(11/40);全部反应可在1 h内完成。通过添加荧光染料SYBR Green I可直观目测实验结果。结论:建立的LAMP方法,具有特异、准确、灵敏、快速、简便的特点,可用于实验小鼠Se V的快速检测。
- 王会娟王蕾严磊皮广禄王胜谭毅赖国旗
- 关键词：小鼠仙台病毒环介导等温扩增
- 大鼠CB1基因真核表达载体的构建及其对CaSki细胞凋亡的影响被引量：2
- 2015年
- 目的构建大鼠CB1(r CB1)基因真核表达载体,检测r CB1基因在细胞中的表达,研究r CB1对人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的影响。方法从大鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增r CB1基因,通过酶切、纯化、连接PCR纯化产物与p CDNA 3.1(+)质粒,构建pc DNA3.1(+)-r CB1。脂质体法将其转染到HEK293和Ca Ski细胞,Western blot及细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测r CB1的表达及定位,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot与实时荧光定量PCR检测r CB1、Bcl-2、Bax、Bad表达。结果酶切重组质粒获得5300 bp的载体片段和1500 bp的目的片段,测序结果和r CB1基因序列(NM_012784.4)一致。转染HEK293细胞后,r CB1在HEK293细胞细胞膜和细胞质表达。转染Ca Ski细胞后,r CB1使细胞凋亡率增加(P<0.05);r CB1基因上调Bax、Bad的表达,同时抑制Bcl-2的表达,与空白组比较,其差异具有显著性(P<0.05)。结论成功构建了pc DNA3.1(+)-r CB1真核表达载体,r CB1表达于细胞膜和细胞质,r CB1可以明显促进宫颈癌Ca Ski细胞凋亡,其机制是上调Bax、Bad和抑制Bcl-2表达。
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- 关键词：HEK293细胞CASKI细胞细胞凋亡
- 检测小鼠肝炎病毒的SNaPshot分型技术及其应用被引量：1
- 2016年
- 建立一种能对MHV1、MHV3、JHM、A59 4种常见小鼠肝炎病毒（Murine Hepatitis Virus,MHV）进行分型检测的SNa Pshot新方法。根据MHV 4种常见毒株基因序列比对结果,设计内外两对PCR通用引物和4个单碱基延伸引物,提取MHV 4种常见毒株RNA,逆转录后进行PCR扩增,纯化扩增产物,用SNa Pshot方法进行单碱基延伸,将产物进行毛细管凝胶电泳,根据电泳结果分析毒株基因型。优化SNa Pshot分析条件,进行灵敏度、特异性分析。用ELISA法和SNa Pshot方法检测41例小鼠（Mus musculus）血清样本,将阳性样本进行克隆测序检测。当T1-T4引物修饰的poly T的数量分别为0、3、10和15,其浓度比为4：6：5：10,引物大小分别为16 bp、19 bp、26 bp和31 bp时,SNa Phot分型检测MHV c DNA的最低浓度为1.25 mg/L,特异性为100%,与ELISA和T-克隆测序比较,其准确性为100%（41/41）,阳性样本均为JHM毒株。实验结果说明,所建立的SNa Pshot检测方法能对MHV1、MHV3、JHM、A59进行分型检测,并且具有灵敏、特异、准确的优点。
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- 关键词：小鼠肝炎病毒酶联免疫吸附试验
- 反向斑点杂交检测泰泽病原体被引量：3
- 2014年
- 目的建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体(Tyzzer’s organism)的反向斑点杂交方法(reverse dot blot,RDB)。方法根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针,上游引物用生物素标记,进行PCR扩增,建立反向斑点杂交方法,用此法进行了特异性和灵敏度实验,同时,用RDB、ELISA和IFA对41只小鼠、38只大鼠进行了检测。结果 RDB特异性强,最低检测限为4.5 ng/μL。对79例实验动物的检测中,与ELISA检测结果一致性为100%,阳性率是7.59%(6/79);与IFA一致性为92.4%(73/79),IFA阳性率是0%。结论建立了PCR扩增与分子杂交相结合的准确、灵敏、特异的泰泽病原体反向斑点杂交检测方法。
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- 关键词：反向斑点杂交实验动物
- 人2型大麻素受体过表达诱导宫颈癌Caski细胞凋亡被引量：3
- 2015年
- 目的构建人2型大麻素受体(h CB2R)基因真核表达载体,探讨h CB2R在细胞中的表达、定位以及h CB2R对宫颈癌Caski细胞的生长的影响及机制。方法构建GV230-h CB2R质粒,经双酶切、测序鉴定后,转染HEK293细胞和Caski细胞,Western blot法及免疫荧光细胞化学染色联合激光扫描共聚焦显微镜技术检测CB2R表达及细胞定位;流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法及实时荧光定量PCR检测h CB2R、Bcl-2、Bax、Bad的表达。结果双酶切获得1128 bp的目的片段,测序结果与h CB2R基因注册序列(NM_001841.2)的同源性为99%;转染HEK293细胞后,可表达相对分子质量(Mr)40 000的h CB2R蛋白,HEK293细胞膜和细胞质中均有CB2R表达;过表达的CB2R,可上调Bax、Bad的表达,抑制Bcl-2的表达,促进宫颈癌Caski细胞凋亡。结论上调Caski细胞h CB2R表达可增强Bax、Bad表达,抑制Bcl-2表达,诱导细胞凋亡。
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- 关键词：HEK293细胞宫颈癌细胞
- 利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型
- 2015年
- 目的通过水动力法注射乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)构建C57BL/6小鼠慢性乙型肝炎病毒感染的模型。方法取29只C57BL/6小鼠,分为实验组、对照组和空白组,应用水动力法分别注射HBV cccDNA、pAAV-HBV1.2及等渗盐水,于注射后收集不同时间点的血清和肝组织。利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg);荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数;免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和乙型肝炎病毒核心抗原(HBc Ag)的表达;苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化;使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。结果实验组HBsAg和HBeAg表达均呈现4个上升-下降曲线:HBsAg峰值分别出现在第3天、第3周、第7周和第9周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第1周、第4周和第10周。对照组HBsAg和HBeAg表达分别呈现2个或3个明显的峰:HBsAg峰值分别出现在第3天和第8周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第3周和第10周。空白组未检测出HBsAg和HBeAg。实验组HBV DNA拷贝数高于对照组的拷贝数(P<0.01);肝组织中HBV DNA拷贝数高于同期血清中的拷贝数(P<0.01);实验组和对照组的肝组织中均有HBsAg和HBc Ag的表达;实验组与对照组出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化,而空白组正常。结论利用水动力法向C57BL/6小鼠体内转入HBV cccDNA,成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,与对照组比较,新建立的小鼠乙肝模型具有更高的HBV表达,动物模型为研究乙型肝炎病毒HBV cccDNA的感染及其引起肝损伤的机制奠定了基础。
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- 关键词：乙型肝炎病毒小鼠模型
- 小鼠绿脓杆菌和仙台病毒LAMP检测方法的建立及其初步应用
- 实验动物是生命科学研究中最基本的四大支撑要素之一，动物实验科学研究的重复性和准确性要有实验动物的质量作保障。在现代医学研究和生命科学研究中，小鼠是最常用的实验动物，其微生物质量将直接影响实验结果的准确性。 根据 GB1...
- 王会娟
- 关键词：环介导等温扩增绿脓杆菌仙台病毒实验动物
- 小鼠肝炎病毒反向斑点杂交检测方法的建立及初步应用被引量：1
- 2014年
- 目的建立一种反向斑点杂交方法(reverse dot blots,RDB)以检测小鼠肝炎病毒。方法用MHV四个毒株分别感染L929细胞,收获病毒提取RNA并逆转录成cDNA;根据MHV保守区基因组序列设计引物和探针,将上游引物5'端用生物素标记。进行PCR扩增,应用PCR产物进行反向斑点杂交,优化杂交条件,进行稳定性、特异性和灵敏度实验,建立反向斑点杂交法。用此法和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对41只小鼠进行检测。RDB检测结果阳性样本进行T载体克隆测序。结果试剂条4℃保质期为8个月。分别检测MHV、金黄色葡萄球菌、沙门菌和乙型肝炎病毒,仅MHV为阳性,RDB特异性为100%,且MHV PCR产物最低检测限为5 ng/μL。41只小鼠经本方法检测后,有5只MHV阳性,分布于3个群,而ELISA检测结果有5只阳性,分布于2个群,阳性样本T载体克隆测序结果与RDB检测结果一致。结论该方法具有简洁明了、稳定可靠、特异性好、灵敏度高等优点,可应用于实验动物小鼠肝炎病毒的检测。
- 赵婷婷严磊魏立雯韦莉王会娟谭毅赖国旗
- 关键词：实验动物反向斑点杂交
