曾怡
- 作品数：29 被引量：68H指数：6
- 供职机构：南京医科大学基础医学院微生物学系与免疫学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金霍英东青年教师基金南京医科大学科技发展基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 卡波济肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原编码基因的克隆及表达被引量：1
- 2004年
- 目的:分离卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏相关核心抗原(LANA)羧基端基因(ORF73C),并在大肠杆菌中克隆和表达。方法:设计一对PCR引物,在引物的5′端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点,提取稳定状态的BCBL-1细胞的总DNA作模板,通过PCR扩增KSHV ORF73C,PCR产物经双酶切后按正确的读码框克隆进原核表达质粒pGEX-6p-1中,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果:经核酸序列测定及分析,分离、克隆的ORF73C基因与基因数据库中登记的ORF73基因的羧基端的621bp的序列有99％同源性。经IPTG诱导的重组质粒转化菌体SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳显示有大小约为46ku的融合蛋白表达。结论:初步表明ORF73C基因在大肠杆菌中获得正确表达。
- 黄丽卢春曾怡
- 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒原核表达
- SARS病毒M蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达被引量：4
- 2004年
- 目的:克隆SARS冠状病毒膜蛋白M胞外区编码序列,并将其置于大肠杆菌作融合表达。方法:从GenBank获得SARS病毒BJ01株膜蛋白M编码基因序列,人工合成其氨基端129-base-pair(bp)双向单链DNA序列,在5′和3′端分别引入BamH I、Xho I酶切位点,退火后形成双链DNA,常规法将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含M蛋白编码基因的重组原核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果:核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的129 bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ01毒株序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),显示有一个大小为30.1 ku的融合表达蛋白产生。结论:M蛋白氨基端胞外区129 bp编码基因在E.coli中获得正确表达。
- 钱超姚堃卢春贾雪梅曾怡黄丽姜平
- 关键词：SARS冠状病毒M蛋白原核表达
- 卡波济肉瘤相关疱疹病毒编码IL-6基因的分离克隆及在NIH3T3细胞中的表达研究被引量：8
- 2006年
- 目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达。方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增vIL-6基因,PCR产物经双酶切克隆进真核载体pcDNA3.1(+)。进一步在原有的下游引物5′端加上一段flag序列,以经过序列测定正确的重组质粒为模板,PCR扩增vIL-6-flag融合基因,构建含vIL-6-flag的重组质粒。将该质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选获细胞抗性克隆。最后用抗flagM2单克隆抗体进行Westernblot检测vIL-6在NIH3T3细胞中的表达。结果:获得vIL-6-flag融合基因,全长671bp,其中vIL-6基因核苷酸序列与GenBank中所登记的KSHVvIL-6基因呈现100%同源性。Westernblot结果显示,在约25ku位置有目的条带,与预期的重组vIL-6-flag融合蛋白大小一致。结论:KSHVvIL-6编码基因在NIH3T3细胞中初步获得表达。
- 陈秀英卢春程林曾怡姚水洪秦娣
- 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒真核表达
- HHV-8 ORF50启动子区序列分离、鉴定及在293细胞中启动活性分析被引量：3
- 2003年
- 目的:分离和鉴定人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF50基因上游启动子区序列,评价其在293细胞中启动活性。方法:以佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增HHV-8 ORF50启动子区序列,克隆进pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因上游多克隆位点,分别构建含正反双向ORF50启动子重组报告质粒,并分别转染293细胞,作Lu-ciferase活性检测,计算相对Luciferase活性单位(RLU)。结果:①克隆的HHV-8 ORF50启动子区序列长655碱基(bp),含多个潜在推测AP1、SP1和ERE等转录因子结合序列;②ORF50启动子与正常pGL-3基本载体相比,其RLU增加了26.3倍;③TPA刺激后ORF50启动子与刺激前相比启动活性增加了4.1倍。结论:HHV-8 ORF50启动子区序列在293细胞中具有较强的启动活性;TPA可以作为一有效的阳性对照刺激物用于进一步鉴定ORF50启动子特性。
- 卢春黄丽曾怡徐亚林
- 关键词：人类疱疹病毒8型启动子活性
- 胰腺癌反义K-ras癌基因片段的分离和克隆被引量：1
- 2003年
- 目的:分离及克隆胰腺癌基因组中K-ras基因片段,构建重组反义K-ras癌基因逆转录病毒载体,并探讨其意义。方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHⅠ和EcoRⅠ位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1及侧翼序列,并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN-Z中,并经菌液PCR和限制性内切酸酶切鉴定。结果:K-ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆入LZRSpBMN-Z中。结论:LZRSpBMN-Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K-ras目的基因外显子1方便可行,可用于重组反义K-ras癌基因逆转录病毒载体的构建。
- 蒋奎荣刘训良卢春苗毅戴存才徐泽宽曾怡黄丽
- 关键词：胰腺肿瘤反义克隆
- 开放读码框架50基因介导HIV-1感染相关的肝细胞生长因子诱导人类疱疹病毒8型复制被引量：3
- 2004年
- 目的 研究人类疱疹病毒 8型 (HHV 8)开放读码框架 (ORF) 5 0基因启动子在HIV 1感染相关细胞因子肝细胞生长因子 /驱散因子 (HGF/SF)诱导原发性渗出性淋巴瘤 (PEL)BC 3中潜伏感染的HHV 8复制过程中的作用。方法 将HGF/SF连续加入到体外培养的BC 3中 ,分别于培养第 3天和第 7天收集刺激细胞 ,电子显微镜观察成熟HHV 8病毒的形成 ;提取细胞总RNA ,North ernblot和定量聚合酶链反应 (PCR)法检查HHV 8次要衣壳蛋白ORF2 6mRNA转录。同时 ,将已构建的HHV 8ORF5 0启动子 +虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV 1Tat基因重组表达质粒分别共转染BC 3和人脐静脉血管内皮细胞 (HUVECs) ,转染后 2 4h加入HGF/SF和 /或重组HIV 1gp12 0刺激 ,刺激后 2 4h收集细胞 ,进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯 (TPA)刺激为阳性对照。结果 HGF/SF可以上调HHV 8ORF2 6mRNA表达 ,且于刺激的第 7天 ,ORF2 6mRNA表达上升了 4 .1倍 ,BC 3细胞中同时可观察到成熟的HHV 8病毒粒子 ;HGF/SF能够诱导ORF5 0启动子活性 ,但HIV 1Tat和 gp12 0蛋白与HGF/SF协同上调ORF5 0启动子活性的能力较弱。 结论 HIV 1感染相关细胞因子HGF/SF诱导HHV 8复制的过程至少有部分由ORF5 0启动子介导。
- 卢春曾怡钱超唐桂霞
- 关键词：肝细胞生长因子启动区
- JAK/STAT通路在HIV-1胞内Tat蛋白激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒裂解周期复制中的作用
- 人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1，HIV-1)感染显著提高卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’ssarcoma-associated herpesvirus，K...
- 曾怡
- 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒TAT蛋白
- 文献传递
- HIV-1感染相关细胞因子IFN-γ通过Rta基因启动子激活人类疱疹病毒8型被引量：9
- 2004年
- 目的 研究HIV 1感染中相关细胞因子IFN γ对人类疱疹病毒 8型 (HHV 8)Rta基因启动子活性影响 ;评价Rta基因启动子在多种细胞中的启动活性。方法 将已构建的HHV 8Rta启动子 +虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV 1Tat基因重组表达质粒转染多种细胞 ,转染后 2 4h加入IFN γ和 或重组HIV 1gp12 0刺激 ,刺激后 2 4h收集细胞 ,进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯类化合物TPA刺激为阳性对照 ,进行最佳刺激时间点的选择和不同转染方法转染效率的比较。结果 ①HHV 8Rta启动子启动活性在TPA刺激后的 2 4h达到最高峰 ;②HHV 8Rta启动子启动活性的发挥不依赖于HHV 8和 或EBV基因组的存在 ,且在血管内皮细胞 (HUVECs)中启动活性最佳 ;③IFN γ可以诱导Rta启动子活性 ;但HIV 1Tat和gp12 0蛋白与IFN γ协同上调Rta启动子活性的能力较弱。结论 HIV 1感染中相关细胞因子IFN γ至少部分通过Rta基因启动子激活HHV
- 卢春曾怡黄丽钱超唐桂霞
- 关键词：IFN-Γ基因启动子人类疱疹病毒8型基因重组质粒
- SARS病毒S蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达被引量：2
- 2004年
- 目的 克隆传染性非典型肺炎 (SARS)病毒纤突蛋白S氨基端编码序列 ,并将其置于大肠杆菌作融合表达 ,为快速检测SARS病人IgM提供抗原。方法 从GenBank获得SARS病毒BJ0 1株纤突蛋白S基因序列 ,人工合成其氨基端 5 0 1bp双链DNA序列 ,在 5’和 3’端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点。常规法将其克隆到 pBluescriptⅡSK(+)质粒中进行核酸序列测定 ,进一步将其克隆进原核表达载体pGEX 6 p 1中 ,构建含S蛋白基因的重组原核表达质粒。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌 (E .coli)BL2 1感受态细胞 ,以异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达融合蛋白。结果 核酸序列测定与分析的结果表明 ,克隆的 5 0 1bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ0 1毒株序列呈现 10 0 %同源性。IPTG诱导后的菌体 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ,显示有一个大小为 4 2ku的融合表达蛋白产生。结论 S蛋白氨基端 5 0 1bp编码基因在E .coli中获得正确表达 ,为进一步研究提供了实验室资料。
- 贾雪梅钱超卢春姚堃曾怡黄丽姜平
- 关键词：SARS病毒大肠杆菌克隆传染性非典型肺炎原核表达
- 姜黄素对人卵巢癌细胞株HO-8910增殖和凋亡的影响被引量：8
- 2005年
- 目的:探讨姜黄素(curcumin)对体外培养人卵巢癌细胞株HO鄄8910细胞增殖、细胞周期调控及细胞凋亡的影响。方法:选用人卵巢癌细胞株HO鄄8910进行体外培养,以1.25-20μg/ml姜黄素分别处理HO鄄8910细胞6鄄24h,倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测凋亡和细胞周期,SABC免疫组化检测细胞凋亡相关蛋白Fas、Fas鄄L、Bcl鄄2及Bax的表达。结果:姜黄素对HO鄄8910生长有抑制作用,并呈剂量时间依赖性。流式细胞仪分析证实姜黄素能使HO鄄8910细胞积聚在S和G2/M期,并出现亚二倍体凋亡峰。Fas、Fas鄄L、Bcl鄄2表达均上调,Bax加药前后均为阳性。结论:姜黄素对人卵巢癌细胞株HO鄄8910的增殖具有显著的抑制作用;Fas、Fas鄄L、Bcl鄄2的表达上调可能参与了诱导细胞凋亡。
- 王清王淑玉贾雪梅黄丽曾怡唐桂霞
- 关键词：姜黄素卵巢癌凋亡
