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李鹏飞: 作品数：18 被引量：71H指数：6; 供职机构：贵州大学动物科学学院更多>>; 发文基金：贵州省科学技术基金贵州省科技计划项目国家自然科学基金更多>>; 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>

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山羊IFN-γ和TNF-α基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：6: 2017年; 根据GenBank中山羊γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因。将IFN-γ、TNF-α基因克隆至p MD-19-T载体,得到各自阳性克隆质粒,以2种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。应用所建立的方法检测刀豆蛋白A(Con A)刺激健康山羊外周血单核细胞(PBMC)后不同时间点IFN-γ、TNF-α基因转录量。结果表明,当质粒标准品稀释度为1×10~9copies/L^1×10~5copies/L时,扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.999和1.000;熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。IFN-γ在第2小时和第48小时这两个时间点出现mRNA转录高峰,在第2小时检测到IFN-γ转录量为1.26×10~5copies/L,第48小时检测到转录量为8.56×10~4copies/L;TNF-α在0~24 h呈现下调的表达趋势,第48小时出现mRNA转录高峰,转录量为2.73×10~5copies/L;研究结果将为IFN-γ、TNF-α的定量分析提供技术平台。; 李婷张益张益鲜思美冯将冯将; 关键词：山羊实时荧光定量RT-PCR SYBR

一起南江黄羊地方性鼻内肿瘤的病理学观察被引量：3: 2017年; 为了对羊地方性鼻内肿瘤的诊断和防治提供理论依据,对贵州省一起南江黄羊地方性鼻内肿瘤病例进行了临床症状与病理学观察。结果表明:患病南江黄羊临床上以面部肿胀、张嘴呼吸、鼻腔流出浆液性分泌物、呼吸困难与有鼻塞音等呼吸道症状和进行性消瘦为特征;肿瘤起源于筛骨黏膜,呈单侧生长、菜花状、粉红色,质脆,无包膜,表面覆盖大量黏液,完全占据单侧鼻腔;组织学上,鼻内肿瘤主要表现为腺管状生长,腺管管腔内充盈大量红染均质渗出物,有腺管共壁现象,瘤细胞偶见病理性核分裂象等;未发现肿瘤向其他组织与器官转移。; 鲜思美李鹏飞李鹏飞冯将冯将包细明张益张益; 关键词：南江黄羊流行病学临床症状病理学

羊口疮病毒大足株的分离鉴定被引量：2: 2019年; 本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒(orf virus,ORFV)流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料,提取病料DNA,经PCR鉴定为ORFV阳性;将阳性病料做常规处理,接种羔羊睾丸细胞(LT),并盲传至5代,观察接毒LT细胞病变,将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验(IFA)、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID 50测定。结果显示,经PCR检测,18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%(11/18);大足株病料接种LT细胞36 h后,长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩,72 h后大部分细胞脱落;间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光,且荧光绕核分布;F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带,大小为1137 bp;将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对,其核苷酸同源性在97.9%~100%之间,与美国SA00分离株同源性达100%,且遗传进化分析显示处于同一进化分支,亲缘关系较近;测定F5代细胞培养物TCID 50值为10-5.68/0.1 mL,在细胞中能稳定增殖。综上所述,本研究成功分离并获得1株ORFV,为后续ORFV研究提供了生物材料,同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。; 李鹏飞张友鲜思美李婷李婷张益张益吴伯梅; 关键词：遗传进化分析

山羊IL-2基因SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：3: 2016年; 为建立山羊IL-2基因SYBR GREEN I实时荧光定量RT-PCR检测方法，根据GenBank中山羊见-2基因（登录号：KT934548），设计1对特异性引物，用于扩增目的基因，并将目的基因克隆于pMD-19-T载体，转化至大肠杆菌DH50L，经质粒PCR及序列测定鉴定后获得阳性重组质粒，作为标准品模板建立SYBR GREEN I RTFQ-PCR标准曲线和溶解曲线，进行特异性、重复性和敏感性试验。并应用所建立的方法，检测ConA刺激健康山羊PBMC后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h和48h不同时间点IL-2基因转录的动态变化。结果表明，当质粒标准品稀释度在7．2×10^9-7．2×10^5copies／μL扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系，相关系数为一0．996；熔解曲线为特异性单峰，组内变异系数为0．306％～1．458％，组间变异系数为0．514％～1．191％，最低检测限为7．2×10^2copies／μL。山羊IL-2基因的mRNA转录量在0～2h呈现上升趋势，在2h达到峰值，2-6h呈现下降趋势。6～12h未能检测到IL-2基因的mRNA转录；12～48h检测到IL-2基因的mRNA转录量呈逐渐上升趋势。研究结果将为山羊IL-2基因的定量分析提供技术平台。; 李婷丁尊俄鲜思美黄佑洪刘嫒冯将李鹏飞; 关键词：山羊实时荧光定量RT-PCR SYBR

贵州黑山羊、黔北麻羊IL-2基因的克隆与生物信息学分析: 2018年; 为获得贵州特色品种黑山羊与黔北麻羊IL-2基因,本试验以Con A刺激的贵州黑山羊与黔北麻羊外周血淋巴细胞为材料,采用RT-PCR方法分别扩增贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因,进行克隆与生物信息学分析。结果显示,（1）贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因核苷酸与氨基酸一致性为100%,完整编码阅读框大小为468 bp,编码155个氨基酸;（2）黔北麻羊、贵州黑山羊IL-2基因与Gen Bank中羊源IL-2基因核苷酸一致性为95.9%~100%,氨基酸一致性为91.1%~100%;（3）遗传进化树结果表明,贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因处于同一进化分支,与羊源IL-2基因亲缘关系较近;（4）生物信息学分析结果显示,IL-2蛋白二级结构中以α螺旋与无规则卷曲较多,该蛋白为亲水性蛋白,含信号肽序列,无跨膜结构,无特征功能结构域;（5）不同动物IL-2蛋白的抗原性分析存在差异,贵州黑山羊/黔北麻羊IL-2蛋白与羊源IL-2蛋白的比较差异较小,与人和其它动物的比较差异较大。由此得出结论,获得贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因完整编码区序列,二者核苷酸与氨基酸序列一致。贵州黑山羊/黔北麻羊IL-2基因与羊源IL-2基因亲缘关系近,预测其编码的蛋白为亲水性的分泌型蛋白,不同动物IL-2基因抗原性存在差异。; 鲜思美李鹏飞刘嫒李婷包细明张益冯将; 关键词：贵州黑山羊黔北麻羊 IL-2基因

羊口疮病毒PMA-PCR检测方法的建立被引量：3: 2022年; 【目的】为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理,通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度;分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度,进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化,确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件;对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证,并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】OrfV样本经60℃热水浴处理10 min即可被完全灭活;PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35μmol/L;特异性试验结果表明,该方法检测活OrfV时出现阳性条带,而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性;经PMA处理后,在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10^(-1.68)TCID_(50)/0.1 mL。【结论】本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术,该方法特异性强、敏感度高,可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。; 梁倩包涛涛鲜思美杨倩李鹏飞李鹏飞郑维豪杜鹏青成欣; 关键词：活性检测

贵州一起南江黄羊地方性鼻内肿瘤的病理学观察: 引言羊地方性鼻内肿瘤(Enzootic nasal tumor,ENT)又称传染性鼻内肿瘤、传染性鼻内腺癌或者传染性乳头状瘤,是由绵羊肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of sheep,EN...; 包细明李鹏飞冯将张益李婷鲜思美

羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达被引量：16: 2015年; 目的为构建羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒,同时验证其在MDBK细胞中的表达。方法本试验以pVAX1为真核表达载体,在前期构建的克隆质粒pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L基础上,构建真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L,对其分别进行双酶切和测序鉴定,将鉴定正确的真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L转染至MDBK细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测目的基因表达。结果双酶切鉴定和序列测定表明真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L构建成功,RT-PCR和IFA同时验证目的基因在MDBK细胞浆中能瞬时表达。结论本试验构建成功的真核表达质粒为下一步羊口疮病毒核酸疫苗研究奠定基础。; 刘嫒冯将鲜思美刘宗胜李鹏飞罗代兵; 关键词：羊口疮病毒 B2L基因真核表达

羊口疮病毒感染MDBK细胞的电子显微镜观察被引量：4: 2018年; 为了研究羊口疮病毒(Orf V)粒子的形态,试验采用透射电镜对Orf V地方分离株感染的体外培养MDBK细胞进行了观察。结果表明:负染痂皮病料悬液的病毒粒子呈卵圆形线团样,表面呈绳索样缠绕结构,大小为150~200 nm×230~270 nm,病毒粒子外有双层被膜包裹;OrfV地方分离株感染MDBK细胞在48 h后可见细胞变圆、聚集、融合、拉网甚至脱落的细胞病变(CPE);超薄切片可见病毒粒子存在于细胞浆内,多呈椭圆形或卵圆形,获得囊膜成熟病毒粒子和未成熟病毒粒子的表面均呈现两种形态,即表面呈绳索样的病毒粒子和表面无绳索样的病毒粒子;细胞超微结构变化主要表现为细胞表面的微绒毛脱落,细胞浆空泡增多,内质网扩张呈囊状。说明OrfV能够在MDBK细胞内增殖。; 鲜思美李鹏飞李鹏飞顾丽群李婷刘宗胜张习本; 关键词：超薄切片电镜

羊口疮病毒DZ株在不同细胞上的增殖特性研究被引量：1: 2021年; 为研究羊口疮病毒(ORFV)DZ株在不同细胞上的增殖特性,将ORFV-DZ株分别接种犊牛睾丸细胞(BT)和鸡胚成纤维细胞(CEF)2种原代细胞,以及山羊皮肤成纤维细胞系(GSFs)、小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)、宫颈癌细胞系(Hela)、牛肾细胞系(MDBK)、犬肾细胞系(MDCK)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)、乳仓鼠肾细胞系(BHK-21)7种传代细胞,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)、TCID_(50)测定和实时荧光定量PCR检测ORFV-DZ株在不同细胞上的增殖特性。结果表明:ORFV-DZ株能在BT、Hela以及MDBK 3种细胞中有效增殖,且出现细胞变圆、聚集、脱落等CPE;IFA检测ORFV-DZ株接种这3种细胞均能出现特异性绿色荧光;收集BT、Hela和MDBK细胞培养的F5代细胞毒,测得其TCID_(50)值分别为10^(-5.81)·0.1 mL^(-1)、10^(-4.22)·0.1 mL^(-1)、10^(-4.88)·0.1 mL^(-1);qPCR检测结果中,ORFV-DZ株在BT细胞中随传代次数增加病毒拷贝数未发生明显变化,在MDBK细胞中F5代时病毒拷贝数已下降,而在Hela细胞中,随着传代次数的增多,病毒拷贝数逐步下降。这一研究得到了适合ORFV-DZ株有效增殖的细胞为BT和MDBK,为后续ORFV的基础研究以及疫苗研发等提供了细胞学研究基础。; 杨倩李鹏飞鲜思美鲜思美张友闵德省梁倩顾庆林; 关键词：羊口疮病毒细胞

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