黄雯 作品数:2 被引量:27 H指数:2 供职机构: 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室 更多>> 发文基金: 公益性行业(农业)科研专项 国家自然科学基金 国家科技支撑计划 更多>> 相关领域: 农业科学 更多>>
PMA-PCR方法快速检测VBNC状态青枯菌 被引量:6 2016年 青枯菌为应对逆境胁迫,可进入活的但非可培养状态(viable but non-culturable,VBNC)。本文利用叠氮溴化丙锭(PMA)与PCR技术相结合,建立了一种快速有效区分青枯菌死活细胞的分子检测方法。基于hrcS基因序列,设计了一对青枯菌种特异性检测引物hrcSf/hrcSr;利用PMA对青枯菌Po82菌株的细胞悬浮液样品进行预处理,随后进行常规PCR扩增。结果表明,当样品中PMA质量浓度为3μg/mL、曝光时间大于5min时,PMA可有效抑制死亡菌体细胞中的DNA扩增;且对可培养和VBNC状态细胞中的DNA扩增没有影响;本试验建立的PMA-PCR方法能有效对包括VBNC状态在内的青枯菌活菌进行检测,避免了假阳性与假阴性结果的产生。 于小龙 徐进 张昊 许景升 黄雯 胡晓梅 冯洁 王学利关键词:青枯菌 植物青枯菌LAMP检测方法的建立 被引量:22 2016年 【目的】由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,简称青枯菌)引起的青枯病(bacterial wilt of plants)是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一,严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术,是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的lpx C基因序列,并利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0得到4条LAMP特异性引物,F3(5′-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′)、B3(5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′)、FIP(5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3′)、BIP(5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′)。通过单因素变化试验对LAMP反应体系中的各参数进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,设置镁离子浓度为2、4、6、8、10、12 mmol·L-1,设置内外引物浓度比为2﹕1、4﹕1、6﹕1、8﹕1、10﹕1、12﹕1,确定最优反应体系。以分离自不同寄主的24个青枯菌株为参试对象,5个非青枯菌株(Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia)为对照,验证LAMP检测方法的特异性。将青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA进行10倍梯度系列稀释,以原液和10~1、10~2、10~3、10~4、10~5、10~6、10~7倍的稀释液为模板同步进行LAMP和普通PCR检测,比较两者的检测灵敏度。将马铃薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分别与马铃薯块茎和生姜根茎组织悬浮液混合,以LAMP检测方法对混合物进行检测,并以同样方法对表现典型萎蔫症状的人工接种番茄植株和健康植株以及田间马铃薯罹病块茎样品进行检测。反应结果直接通过观察产生的白色焦磷酸镁沉淀情况进行判定,或通过加入1μL SYBR GreenⅠ荧光染料进行观察,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。� 黄雯 徐进 张昊 许景升 丁伟 冯洁关键词:青枯菌 环介导等温扩增